基于网络药理学探讨大黄牡丹汤治疗溃疡性结肠炎的作用机制

朱茜　龙再菊

摘要 目的：分析大黄牡丹汤的有效化学成分及作用靶点，研究其治疗溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）的作用机制。方法：运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索大黄牡丹汤的活性成分及靶点蛋白;应用基因组注释数据库平台（Genecards）预测疾病的作用靶点，再将药物-靶点-疾病关系制作成网络图形式。通过String数据库平台构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，寻找PPI核心基因，再进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，找出所涉及的信号通路，构建靶点-通路网络图。结果：通过筛选，搜索出大黄牡丹汤治疗UC的关键化学成分18个，共同靶点28个，得到15个PPI核心基因，分别为MYC、JUN、CASP3、ESR1、PTGS2、HSP90AA1、CASP8、CASP9、IL1B、CCNB1、CDKN1A、CHEK1、PPARG、BAX、KDR。GO富集分析发现紫外线应答、膜筏、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程等;KEGG富集通路分析发现P53信号通路、小细胞肺癌信号通路、乙型肝炎信号通路、大肠癌信号通路等。结论：大黃牡丹汤可通过调节PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、BAX、CASP3、ESR1、ESR2、FASN、JUN、NOS2等靶点，调控P53信号通路等来抑制炎症反应、调节免疫功能对UC起到治疗作用。

关键词 网络药理学;大黄牡丹汤;溃疡性结肠炎;作用机制;生物信息技术;中药系统药理学数据库与分析平台;炎症反应;免疫功能

Mechanism of Dahuang Mudan Decoction in the Treatment of Ulcerative Colitis Based on Internet Pharmacology

ZHU Qian，LONG Zaiju

（Department of Large Intestine，the Third Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110005，China）

Abstract Objective：To analyze the effective chemical components and action targets of Dahuang Mudan Decoction，and to study the mechanism of its treatment for ulcerative colitis（UC）.Methods：Chinese Medicine System Pharmacology Technology Platform（TCMSP） database was used to search for the active ingredients and target proteins of Dahuang Mudan Decoction; the genomic annotation database platform（Genecards）was used to predict the target of the disease，and then make the drug-target-disease relationship into a network Graphic form; the PPI network was constructed using the String database platform，and we searched for PPI core genes，and then performed GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis to find out the signal pathways involved and constructed a target-path network graph.Results：After screening，a total of 18 key chemical components of Dahuang Mudan Decoction for UC were obtained，and 28 common targets were obtained，and 15 PPI core genes were obtained，namely MYC，JUN，CASP3，ESR1，PTGS2，HSP90AA1，CASP8，CASP9 IL1B，CCNB1，CDKN1A，CHEK1，PPARG，BAX，KDR; GO enrichment analysis results included ultraviolet stress，membrane raft，cysteine-type endopeptidase activity involved in the apoptosis process，etc; KEGG enrichment pathways included P53 signaling pathway，small cell lung cancer signaling pathway，hepatitis B signaling pathway，and colorectal cancer signaling pathway.Conclusion：Dahuang Mudan Decoction can inhibit inflammation and regulate immune function by regulating the targets of PTGS2，PTGS1，HSP90AA1，BAX，CASP3，ESR1，ESR2，FASN，JUN，NOS2，etc.to suppress inflammation and regulate immune function.

Keywords Network pharmacology; Dahuang Mudan Decoction; Ulcerative colitis; Mechanism of action; Bioinformatics; Technology platform for traditional Chinese medicine system pharmacology; Inflammatory response; Immune function

中图分类号：R289.5;R574文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.001

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）属慢性非特异性炎症性肠病，目前病因尚未明了，疾病进展难以评价。UC病位局限于结肠黏膜与黏膜下层，其临床表现主要为腹痛、腹泻、黏液脓血便，易反复发作[1-3]。近年来发病率在全球呈明显上升趋势，但其病因至今尚未确立，多认为与遗传、感染、环境、免疫等因素相互作用有关，其他因素如压力增大、过度劳累、饮食不节均会导致UC的发生与恶化[4-5]。目前在世界范围内尚无治疗UC的指南或共识，柳氮磺胺吡啶水杨酸制剂、类固醇类药物是主要的治疗药物，重症UC常应用手术治疗，此外还有替代补充疗法如粪便移植、益生菌移植等[6-9]。本病治愈难度大，复发率高，且具有较高的癌变率;西药治疗多有不良反应[10-11]。

中医治疗UC能显著提高治疗效果，且可降低不良反应的发生率，能大大改善患者的生命质量和预后[12-13]。溃疡性结肠炎在中医属“久痢”“休息痢”等范畴，《素问·太阴阳明论》云：“大肠属腑，泻而不藏，多实多热。”《东垣十书》中阐述：“夫肠澼者，为水谷与血另作一派……时值长夏，湿热大盛……而主气弱，故肠澼之病甚。”大黄牡丹汤出自《金匮要略·疮痈肠痈浸淫病脉证并治第十八》，该方具有活血祛瘀兼以清热的功效，临床治疗气滞血瘀、热毒蕴结之UC，疗效颇佳[14-15]。本研究应用网络药理学的方法对大黄牡丹汤的有效化学成分进行筛选，探索其治疗UC的靶点基因及信号通路，进而探讨大黄牡丹汤治疗UC的分子作用机制，为进一步研究其中医药作用机制提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 筛选大黄牡丹汤的中药化学成分 通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）对大黄牡丹汤中5味中药的有效成分进行检索，并对每味中药化合物的药物动力学进行筛选（筛选标准：口服生物利用度（OB）≥30%，药物相似性（DL）≥0.18），其中，OB包括生物利用程度和生物利用速度，是指药物被吸收进入机体血液循环的相对量;DL为类药性，反映化合物与已知药物的相似性。

1.2 筛选大黄牡丹汤与UC的共同作用靶点 登录TCMSP数据库，检索大黄牡丹汤每味中药的关键化学成分及靶点信息，并应用uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）将靶点转换为与之相对应的人类基因名称;通过Genecards数据库（https：//www.genecards.org/）检索出UC对应人体的靶点基因，与药物靶点信息一一对照，得到药物-疾病靶点基因及与之对应的关键化学成分。

1.3 关键化学成分-靶点的网络可视化 将药物关键化学成分与疾病的共同靶点基因整理成为基因列表、化合物列表、网络关系等文件，将上述文件导入Cytoscape3.7.2软件进行构建基因-化合物网络图。在这个网络图中，节点代表关键化合物和靶点，边表示节点之间相互作用的关系。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络是指蛋白间相互作用关系网络。打开String数据库（https：//string-db.org/Version 10.5），输入大黄牡丹汤与UC的共同靶点基因，设置蛋白关系评分为0.4，得到PPI网络。其中不同颜色代表不同证据关系，下载PPI关系图和关系数据，筛选出前15个PPI网络核心基因。

1.5 GO富集分析和KEGG富集分析 通过Bioconductor数据库（http：//bioconductor.org/bioc Lite.R）将药物-疾病共同靶点基因转化为基因ID。设置pvalue=0.05，qvalue=0.05进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，输出结果并绘制柱状图，再运用Cytoscape绘图软件构建靶点-信号通路网络图。

2 结果

2.1 大黄牡丹汤化学成分的筛选 应用TCMSP数据库对大黄牡丹汤的4味中药中所含的化学成分进行检索（未检索到芒硝的相關信息），并通过OB≥30%，DL≥0.18标准进行筛选，共得到52个化学成分，其中大黄16个，冬瓜子2个，牡丹皮11个，桃仁23个。见表1。

2.2 药物-疾病靶点预测 通过TCMSP数据库查询点信息，通过Uniprot进行基因ID的注释。通过Genecards和OMIM数据库搜索UC的靶点基因，输入“ulcerative colitis”，获取评分≥5的相关疾病靶点基因共970个，将其与大黄牡丹汤有效化合物的靶进行映射，得到大黄牡丹汤和UC的关键化学成分共18个，并得到药物-疾病共同靶点基因共28个，分别为NOS2、PTGS2、ESR2、DPP4、HSP90AA1、PRSS1、KDR、PTGS1、JUN、ESR1、CHEK1、SLC6A4、BCL2、BAX、CASP9、CASP3、CASP8、PON1、CDKN1A、TNFSF15、FASN、PCNA、MYC、IL1B、PRKCD、CCNB1、PPARG、PLAU。

2.3 藥物关键化学成分-靶点网络构建 通过Cytoscape3.7.2软件将药物-关键化合物-疾病-靶点基因网络进行可视化处理。图中矩阵代表靶点，圆圈代表化合物，其中不同颜色代表化合物来源于不同的药物。其中药物活性成分以“degree”来表示，排名前五的关键化合物为芦荟大黄素（aloe-emodin，MOL000471，degree=13）、β-谷固醇（beta-sitosterol，MOL000358，degree=11）、决明内酯（Toralactone，MOL002281，degree=7）、泽兰黄醇（EUPATIN，MOL002235，degree=7）、（-）-儿茶素（-）-catechin，MOL000096，degree=6）。排名前10的靶点有PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、BAX、CASP3、ESR1、ESR2、FASN、JUN、NOS2。见图1。

2.4 PPI网络分析 该网络包括28个节点，125条边，其中评分≥0.99的PPI蛋白为CASP8-CASP3、CDKN1A-PCNA、MYC-CDKN1A、BCL2-CASP8、CASP8-CASP9、CDKN1A-CCNB1、MYC-JUN。得到前15个PPI核心基因分别为MYC、JUN、CASP3、ESR1、PTGS2、HSP90AA1、CASP8、CASP9、IL1B、CCNB1、CDKN1A、CHEK1、PPARG、BAX、KDR，这些即为大黄牡丹汤治疗UC的核心基因。见图2～3。

2.5 GO功能富集分析 GO主要包括生物过程（Biological Process）、细胞组分（Cellular Component）、

分子功能（Molecular Function）三部分。主要富集的生物过程（BP）包括紫外线应答（Response to UV）、氧气水平应答（Response to Oxygen Levels）、细胞对非生物刺激的反应（Cellular Response to Abiotic Stimulus）、细胞对环境刺激的反应（Cellular Response to Environmental Stimulus）等。见图4。富集的细胞组成（CC）包括膜筏（Membrane Raft）、膜微区（Membrane Microdomain）、膜区（Membrane Region）等，如图5所示。富集的分子功能（MF）包括半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程（Cysteine-type Endopeptidase Activity Involved in Apoptotic Process）、泛素样蛋白连接酶结合（Ubiquitin-like Protein Ligase Binding）、雌激素受体结合（Estrogen Receptor Binding）、内肽酶活性（Endopeptidase Activity）等。见图6。

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析结果显示，大黄牡丹汤治疗UC的关键靶点蛋白主要富集的通路包括P53信号通路（P53 Signaling Pathway）、小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer）、乙型肝炎（Hepatitis B）、大肠癌（Colorectal Cancer）等。见图7。

2.7 靶点-通路网络构建 应用Cytoscape软件将得到的通路和靶点信息绘制成网络图，根据连接节点数目设定degree，形状越大表示富集越显著，网络中的核心靶点为BAX、CASP3、BCL2、JUN、CASP8、CASP9、CDKN1A、MYC等。见图8。

3 讨论

UC患者在发病过程中，肠道微环境的改变起到了重要作用，肠道菌群的抗原对肠道内的免疫细胞具有一定的刺激作用，刺激产生多种细胞因子，包括炎症介质和抗炎因子，二者之间的动态平衡维持着肠道及整个机体的稳态，当上述细胞因子之间的平衡被打破，肠道微生态发生混乱，则造成了UC的发生发展[16-17]。大黄牡丹汤由大黄、牡丹皮、桃仁、冬瓜仁、芒硝五味中药组成，大黄味苦性寒，具有清热解毒、活血祛瘀的功效;牡丹皮味苦、辛，性微寒，具有清热凉血，活血化瘀的功效;桃仁味苦、性平，具有活血祛瘀、润肠作用;冬瓜仁味甘、性平，具有化痰排脓的功效;芒硝性寒、味咸、苦，具有润燥软坚、清火消肿的功效。

本研究中，大黄牡丹汤所含的芦荟大黄素、β-谷固醇、决明内酯、泽兰黄醇、（-）-儿茶素等在对靶点基因的匹配中，具有较高的自由度。芦荟大黄素的抗菌活性较强，对金黄色葡萄球菌及临床常见厌氧菌都有较强的抑制作用，在1.5～25 mg/mL的芦荟大黄素对葡萄球菌、链球菌、炭疽、痢疾杆菌、副伤寒杆菌等具有抑制作用，且具有免疫抑制作用，能抑制生物体的抗体产生，降低白细胞数和巨噬细胞功能。此外，芦荟大黄素还具有抗肿瘤活性，对肝癌、肺鳞癌、胃癌等肿瘤均具有活性[18-20]。β-谷固醇是一种植物甾醇，其分子结构与胆固醇类似，具有降胆固醇作用，同时具有解热抗炎、抗氧化、肿瘤等作用，对免疫系统具有增强作用[21-22]。决明内酯能抑制细菌中核酸的生物合成，对孢子菌、地丝菌等真菌有较强的抑制作用，同时能够降血压、调血脂[23]。儿茶素又名儿茶酸，广泛存在于茶叶中，其直接抗菌作用较强，且广谱和高效，其能够增强细菌细胞膜的通透性，造成细菌死亡，且可影响细菌的基因表达，有研究发现儿茶素可产生过氧化氢，诱导katB、sodM等基因上调，增强细胞对氧化应激和DNA损伤的抵抗作用[24-26]。

本研究的关键靶点蛋白有PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、BAX、CASP3、ESR1、ESR2、FASN、JUN、NOS2等。前列腺素G/H合成酶（PTGS）可将花生四烯酸转化为前列腺素H2（PGH2），在细胞保护中起着重要作用，在血小板中，参与着血栓烷A2（TXA2）的产生，能促进血小板活化和聚集，血管收缩和血管平滑肌细胞的增殖[27]。HSP90AA1是热激蛋白HSP 90-alpha，能够促进特定靶蛋白的合成，参与着细胞周期控制和信号传导[28]。BAX是细胞凋亡调节蛋白，能够通过结合细胞凋亡抑制因子而加速程序性细胞死亡，且在炎症中起着关键介质的作用[29]。CASP3参与负责凋亡的胱天蛋白酶的激活级联反应;ESR为雌激素受体，能够参与真核基因表达的调节，影响靶组织中的细胞增殖和分化。脂肪酸合酶（FASN）催化乙酰辅酶A，丙二酰辅酶A和NADPH形成长链脂肪酸，且作为脂质合成的关键调节剂，由淋巴和炎症组织中的巨噬细胞表达，调节炎症反应。JUN参与大肠癌细胞中USP28的激活的KRAS介导的转录激活;一氧化氮合酶2（NOS2）是一种在全身具有多种功能的信号分子，在巨噬细胞中介导着抗菌和抑制肿瘤的作用。

GO富集分析结果显示，富集的生物过程主要包括紫外线应答、氧气水平应答和细胞对非生物刺激的反应等。KEGG富集分析所涉及的通路包括P53基因、小细胞肺癌、乙型肝炎、大肠癌等信号通路。P53基因是人体的抑癌基因，能够促进血细胞凋亡，组织细胞周期，其诱导的磷酸酶对机体炎症具有调节作用[30-31]。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法，探索了大黄牡丹汤治疗UC的关键化学成分、作用靶点及信号通路，探讨大黄牡丹汤治疗UC多成分、多靶点、多通路的复杂作用机制，证明大黄牡丹汤可以通过抑制炎症反应、调节免疫功能的途径治疗UC，为未来实验及更广泛的临床应用提供了科学依据[32]。

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（2020-06-15收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：第六批全国老中医药专家学术经验继承人项目（国中医药人教发2017-29号）

作者简介：朱茜（1990.04—），女，硕士，主治中医师，研究方向：中医治疗肛肠相关疾病，E-mail：zhuqianqian0101@yeah.net

通信作者：龙再菊（1975.05—），女，学士，主任医师，研究方向：炎症性肠病的诊治，E-mail：491054619@qq.com