乳香-没药治疗类风湿性关节炎的网络药理学和生物信息学分析

唐开强　穆晓红　叶超　刘向春　亓建　康晓乐　王悦　许卢春　王建军

摘要 目的：研究乳香-没药药对治疗类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）的作用机制。方法：依托GEO、GeneCards、OMIM数据库挖掘RA相关基因并进行合并。通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索乳香-没药的有效化学成分和相关靶点，使用Cytoscape 3.8.0软件绘制“药物-成分-靶标-信号途径”的可视化网络。运用STRING数据库构建化合物靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。运用R软件进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果：GEO、GeneCards、OMIM数据库筛选出类风湿性关节炎相关基因4 655个，共筛选出乳香-没药药对主要活性成分46个，对应靶点90个。获得乳香-没药治疗类风湿性关节炎的靶点60个，核心靶点6个。此外，KEGG通路富集结果主要包括流体剪切应力与动脉粥样硬化、AGE-RAGE信号通路、白细胞介素-17信号通路。结论：乳香-没药药对可通过多靶点、多通路来治疗类风湿性关节炎。

关键词 乳香;没药;类风湿性关节炎;网络药理学;生物信息学;作用机制;作用靶点;信号通路

Analysis of Olibanum-Myrrha in the Treatment of Rheumatoid Arthritis Based on Network Pharmacology and Bioinformatics

TANG Kaiqiang， MU Xiaohong， YE Chao， LIU Xiangchun， QI Jian， KANG Xiaole，WANG Yue， XU Luchun，WANG Jianjun

（Department of Orthopedic Rehabilitation， Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Olibanum-Myrrha medicine in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：Relying on GEO， GeneCards， and OMIM databases to mine and merge RA-related genes.The effective chemical components and related targets of Boswellia-Myrrha were searched through TCMSP， and the visual network of “drug-component-target-signal pathway” was drawn using Cytoscape 3.8.0 software.STRING database was used to construct a compound target protein interaction network.R software was used for GO function and KEGG pathway enrichment analysis.Results：The GEO， GeneCards， and OMIM databases were used to screen out 4，655 rheumatoid arthritis-related genes， and a total of 46 main active ingredients of Olibanum-Myrrha pair were screened， corresponding to 90 targets.A total of 60 frankincense-myrrha treatment targets for rheumatoid arthritis and 6 core targets were obtained.In addition， the enrichment results of KEGG pathway mainly include fluid shear stress and atherosclerosis， AGE-RAGE signaling pathway， and interleukin-17 signaling pathway.Conclusion：Olibanum-Myrrha can treat rheumatoid arthritis through multiple targets and multiple pathways.

Keywords Olibanum; Myrrha; Rheumatoid arthritis; Network pharmacology; Bioinformatics; Mechanism of action; Target of action; Signalling pathways

中圖分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.005

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种常见的临床风湿免疫性疾病，据统计全球有接近1%的人患有RA[1]。该病以中年女性多发，临床表现以侵袭性和对称性为特点的关节滑膜炎症，滑膜的增厚、炎症放大及继发形成的血管翳是RA的关键病理环节[2]。最终导致关节强直畸形，原有的功能丧失，亦可导致全身多系统病变，严重影响患者生命质量[3]。“乳香-没药”是颇受医生青睐的传统药对，最早在明朝《证治准绳》中的“乳香止痛散”就可见到其配伍运用[4]。这二者相须为用，对治疗风湿痹痛、跌打外伤和经闭痛经的疼痛具有良好的疗效。在一项治疗RA的465首方剂配伍规律的现代研究中显示，乳香-没药是治疗RA方药中使用频率最高的药对之一[5]，其运用广泛、疗效确切，但目前暂无“乳香-没药”治疗RA的分子作用机制的研究。

网络药理学基于系统生物学、多向药理学以及传统药理学，能够从多重网络的角度阐明不同系统之间的相互作用，与中医整体观念的特点相一致，为预测药物治疗疾病的核心靶点和通路提供了有效的研究途径，也能帮助找到具有治疗希望的中药及其活性化合物[6]。GEO数据库包含生物学领域的大量高通量实验数据，并提供多种疾病的基因表达谱的信息。通过科学的分析方法可有效挖掘其潜在价值，筛选出与疾病发展密切相关的差异基因，从而更广泛全面地收集疾病靶标。本研究将网络药理学和生物信息学的研究方法相结合，找出主要的治疗有效成分，并且预测“乳香-没药”治疗RA的关键靶点和潜在分子机制，以期为临床和相关试验提供客观的理论依据。

1 资料与方法

1.1 GEO芯片获取与RA靶点的收集 以“Rheumatoid Arthritis”为关键词在人类基因数据库（GeneCards，https：//www.GeneCards.org/）[7]和在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，http：//www.omim.org/）[8]检索相关基因。并从GEO数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下载了3个基因表达谱数据文件（GSE1919，GSE55235和GSE55457）进行分析。数据标准化后，运用R软件中的limma包[9]对数据集中RA滑膜组织和正常滑膜组织之间的差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）进行筛查[10]。将P值<0.05视为筛选差异表达基因标准，以|logFC|的值视为筛选基因上下调的标准，为了全面广泛地筛选出指标，以|logFC|>0.5作为筛选标准。将3个基因表达谱数据DEGs的交集基因与GeneCards数据库和OMIM数据库中检索出的致病基因进行合并。

1.2 “乳香-没药”主要活性成分的筛选 通过TCMSP数据库搜集“乳香-没药”所有化学成分，检索截止日期是2020年7月。将口服生物利用度（Oral Bioavailability）和类药性（Drug Like）作为筛选标准，筛选的临界值：OB≥30%，DL≥0.18。需核查药对的所有化学成分，有无重复、遗漏，最后得到有效活性成分的结果并保存在Excel中。

1.3 “乳香-没药”活性成分-靶点-信号通路网络的构建 该药对中包含的活性成分全部在TCMSP数据库中搜集、整理，同时获得该活性成分的靶点。将全球蛋白质资源数据库（UniProt，https：//www.uniprot.org/）[11]用于标准化蛋白质靶点数据，然后使用Cytoscape 3.8.0软件进行构建“药对-活性成分-靶点-信号通路”可视化路径网络图，并分析化合物、靶点二者间的度（Degree）值[12]。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建及核心节点筛选 将得到的靶基因上传至STRING在线数据库，将蛋白质参数得分>0.99设置为最高置信度，获取相应的PPI信息对应网络中的节点，并根据结果分析节点。为了描述节点在PPI网络中的重要性，采用经典的度（Degree）值作为标准来衡量节点在PPI网络中的重要性，并使用Cytoscape软件中的CytoNCA插件[13]来计算上述节点的度值，并以度值筛选核心节点。

1.5 GO生物学功能和KEGG通路富集分析 靶点基因本体（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，旨在阐明靶点蛋白在基因功能和信号传导途径中的作用。本研究将“乳香-没药”与RA交集的靶点蛋白进行基因功能注释和富集分析，以研究其在RA治疗中的基因本体功能及相关信号传导途径。GO和KEGG途径富集分析由R软件中的GOcluster包[14]完成，可视化绘图显示通过GOplot包[15]实现。

2 结果

2.1 GEO芯片获取及RA靶点的收集 通过GeneCards和OMIM数据库分别收集了4 424个和48个与RA相关的靶点。在GEO數据库中下载3个基因表达谱数据（GSE38959、GSE65194、GSE76275）共53个样品，进行差异分析，取交集，获得380个潜在靶点。汇总去重后共得到RA疾病靶点4 655个。见图1。

2.2 “乳香-没药”主要活性成分的选择 收集后，获得了127个乳香的主要化学成分和276个没药的主要化学成分。根据OB≥30%，DL≥0.18临界值筛查后获得活性成分分别是乳香6个、没药40个。经过汇总后没有发现有重复的成分，并在PubChem数据库中进行核查，最终获得了46个有效活性成分。见表1。

2.3 “乳香-没药”成分-靶点-信号途径可视化网络的构建 将上一步得到的46个有效活性成分进行检索、转换后获得“乳香-没药”的靶点90个。使用UniProt（http：//www.uniprot.org/）在线数据库将预测出的与RA相关的4 655个致病靶点名称标准化，然后对“乳香-没药”的治疗靶点与RA的致病靶点取交集得到预测治疗靶点60个以维恩图显示。将60个预测治疗靶点在3个数据集中的差异表达值以热图展现。见图1。最后构建药物-成分-靶点-信号途径的可视化网络图。见图2。

2.4 PPI网络构建及核心节点的筛选 将60个预测治疗靶点上传至STRING11.0在线数据库（https：//string-db.org/）后获取相应的PPI信息。经Cytoscape 3.8.0中CytoNCA插件计算节点度值，若节点的度值是网络中所有节点度值中位数的2倍以上，则可作为核心节点。根据度数列举“乳香-没药”治疗RA排名前20的靶点。见表2。本研究中所有节点的度值中位数为18，从而确定药物-疾病交集互作靶点中的6个关键靶点：IL6、VEGFA、TP53、PTGS2、TNF、EGF。见图3。

2.5 GO和KEGG富集分析结果 在GO富集分析中，“乳香-没药”治疗RA预测靶点的生物学功能包括细胞对药物的反应、对脂多糖的反应、对氧化应激的反应、活性氧代谢的过程等;细胞组分主要在于作用于细胞膜、突触膜上;分子功能主要涵盖类固醇的结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子的结合、磷酸酶结合等。见表3、表4。

在KEGG通路富集分析中，“乳香-没药”治疗RA的预测靶点网络主要涉及流体剪切应力与动脉粥样硬化、AGE-RAGE信号通路、白细胞介素-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、内分泌抵抗、缺氧诱导因子-1信号通路等。见表4、图4。

3 讨论

中医将类风湿性关节炎称为“顽痹”“尫痹”，《黄帝内经·痹论》云：“风寒湿三气杂至，合而为痹”，指出风寒湿三邪侵袭，可致经络壅闭、血气不行。目前认为，风寒湿热邪侵袭关节、肌肉、筋骨，阻滞经络，周流气血不畅而血停，血停则为瘀，湿聚则成痰，痰瘀交结，阻于经络，浸入骨间，致使关节肿胀疼痛。治疗以扶正祛邪、活血化瘀、祛风除湿及散寒清热为基本大法[5]。“乳香-没药”为临床活血行气化瘀的常用配伍药。乳香辛温走窜，善于活血定痛，没药苦泄力强，功在散血化瘀。“乳香-没药”的配伍在RA的临床治疗中使用十分广泛，但目前暂无二者治疗RA的作用机制的研究。

本研究通过GeneCards、OMIM及GEO数据库得到RA致病靶点4 665个，通过构建“药对-成分-靶点-信号途径”网络，获得了46个药对活性成分，60个预测靶点，130条信号通路。60个预测治疗的靶点中，在基因表达谱中可以直接找到57个靶点的数据，并掌握了它们在RA中的表达水平，热图显示出主要的促炎靶点都是呈现高表达的状态。在所有活性成分中，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇的度值远高于其他活性成分。槲皮素具备强大的抗炎及免疫调节的作用，在炎性环境中，其可通过抑制核因子κB的活性从而减少MMP-13产生，并减弱基质降解和细胞凋亡，起着保护软骨的作用[16]。Yang等[17]研究显示，槲皮素可恢復Treg/Th17的平衡从而带有抗炎和调节免疫的作用。β-谷甾醇可降低炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α以及环氧化酶COX-2的水平，也具备一定的抗炎作用[18]。豆甾醇带有强大的抗炎及免疫调节作用，多项研究发现豆甾醇能阻碍IL-1β等炎症介质的释放、阻断核因子κB等炎症通路以及降低MMPs水平从而减轻关节炎症引起的软骨破坏[19-20]。

通过构建PPI网络，发现“乳香-没药”治疗RA的60个预测靶点，其中IL6、VEGFA、TP53、PTGS2、TNF、EGF是网络的核心靶点。血管翳的组织中包含持续增殖的滑膜及新生的血管，同时它也是RA病程发展中发生骨损害的重要因素。血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是目前最强的血管生成因子，VEGFA属于血管内皮细胞生长因子家族，缺氧可在数分钟内使VEGF含量增加近30倍，另外TNF-α，IL-1、IL-6以及NO均可上调VEGF的表达水平，从而促进了新生血管的形成[21-23]。

在RA患者的炎性滑膜、软骨及血管翳中，TNF-α/IL-6水平均显著升高，二者都是强大的炎症介质。在RA中，TNF-α位于多种炎症介质释放的通路上游，只要抑制TNF-α则可以减少多种炎症介质的产生、释放。而IL-6属于趋化因子家族，局部IL-6水平升高刺激关节白细胞的聚集，加速破骨细胞的活化和成熟，刺激滑膜组织增生[23]，也可刺激MMP1、MMP3等细胞因子的表达从而破坏关节骨质。作为诱导炎症介质表达和释放的代谢酶，PTGS2可促进炎症，疼痛和发热。主要针对抑制PTGS2研发的非甾体抗炎药（NSAIDs）是常用的RA对症治疗药物，如广泛运用的塞来昔布等在抑制炎症、缓解疼痛等方面快速有效。

GO富集分析显示主要的生物学功能是氧化应激，细胞氧代谢反应。此外，KEGG通路富集最显著的是流体剪切应力与动脉粥样硬化、AGE-RAGE信号通路、白细胞介素-17信号通路。说明“乳香-没药”可能通过炎症、血管生成、滑膜增生及免疫因子等相关信号通路作用于RA。RA患者体内存在大量的炎症介质会加重氧化应激对血管内皮的损伤，更容易导致动脉粥样硬化，比如IL-6、TNF-α等炎症介质产生的细胞因子，促进了泡沫细胞的形成而加速动脉的粥样硬化[24-25]。如Karpouzas等[26]的研究显示，长期使用如TNF-α拮抗剂（TNF-αi）等生物制剂，可在控制RA病情之外起到防止冠脉粥样硬化的作用。AGE-RAGE信号通路主要参与炎症反应、软骨损伤，调控氧化应激、内质网应激等过程。AGEs与其受体RAGE结合后触发MAPKs，NF-κB等细胞内传导通道的活化，引起大量炎症介质和黏附分子等的释放，进而形成正反馈，引发软骨细胞本身合成和分解代谢的失衡，造成软骨细胞凋亡[27-28]。

综上所述，本研究从整体层面分析了药物与疾病的关系，找到了主要的治疗成分，初步预测了“乳香-没药”在RA治疗中起关键作用的靶标及其潜在的作用机制，为接下来深化研究二者药理作用机制提供了思路和依据。

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（2020-09-03收稿 责任编辑：魏庆双，徐颖）

基金项目：北京市自然科学基金项目（7182102）

作者简介：唐开强（1994.06—），男，硕士，医师，研究方向：中西医结合治疗骨关节疾病，E-mail：1322748879@qq.com

通信作者：王建军（1963.09—），男，本科，主任医师，硕士研究生导师，研究方向：中医药治疗骨与关节疾病，E-mail：wangjianjun9988@163.com