养元通络针法干预糖尿病胃轻瘫大鼠的实验研究

王峰　张瑶　徐俊　胡昭端　周晓红　谢有琼　彭锐

摘要 目的：研究養元通络针法对糖尿病胃轻瘫（DGP）模型大鼠胃窦平滑肌SCF-kit通路系统及血清胃促生长素（Ghrelin）、胆囊收缩素（CCK）、5-羟色胺表达的影响。方法：将50只SD大鼠随机分为空白组（N）、模型组（M）、针刺组（A）、假针刺组（SA）、西药二甲双胍组（MET），每组10只。除空白组外，其余4组均采用链脲佐菌（STZ）结合高脂饮食诱导造模。各组大鼠分别于相应干预措施2周后，光镜下观察大鼠胃窦平滑肌形态学改变，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清Ghrelin、CCK、5-羟色胺表达，Western Blotting法检测胃窦干细胞因子（SCF）、c-kit蛋白表达。结果：1）形态组织学改变：与空白组比较，模型组胃窦黏膜不完整，血管数量减少，腺体的排列紊乱，间质细胞数目减少;与模型组比较，针刺组与西药组胃窦黏膜尚完整，腺体排列比较整齐，有较丰富血管，间质细胞数量较多;假针刺组与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。2）与空白组比较，模型组大鼠血清Ghrelin、5-羟色胺表达下降（P<0.05），CCK、血糖水平升高（P<0.05）;与模型组比较，针刺组与西药组血清Ghrelin、5-羟色胺表达上升，CCK、血糖水平下降（P<0.05），假针刺组Ghrelin、CCK、5-羟色胺表达与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。3）与空白组比较，模型组大鼠胃窦SCF、c-kit蛋白表达降低（P<0.05）;与模型组比较，针刺组与西药组大鼠胃窦SCF、c-kit蛋白表达升高（P<0.05）;假针刺组胃窦SCF、c-kit蛋白表达与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：养元通络针法能使DGP大鼠胃窦组织内SCF和c-kit蛋白表达量提升，上调SCF-kit信号系统，提高血清Ghrelin、5-羟色胺表达，降低血清CCK表达，从而改善胃肠动力。

关键词 针刺;糖尿病胃轻瘫;SCF/c-kit信号通路;胃促生长素;胆囊收缩素;5-羟色胺

Experimental Study on the Effect of Nourishing Yuan and Dredging the Meridians Acupuncture in Diabetic Gastroparesis Model Rats

WANG Feng1，ZHANG Yao2，XU Jun1，HU Zhaoduan1，ZHOU Xiaohong1，XIE Youqiong1，PENG Rui1

（1 Hubei University of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430061，China; 2 Wuhan Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine，Wuhan 430022，China）

Abstract Objective：To study the effects of Nourishing Yuan and Dredging the Meridians Acupuncture on the SCF-kit pathway system of gastric antrum smooth muscle and the expression of serum Ghrelin，CCK and 5-HT in diabetic gastroparesis model rats.Methods：A total of 50 SD rats were randomly divided into a blank group（N），a model group（M），an acupuncture group（A），a sham acupuncture group（SA），and a metformin group（MET），with 10 rats in each group.Except the blank group，the other 4 groups were induced by streptozotocin（STZ） and combined with high-fat diet to induce modeling.Rats in each group were observed for 2 weeks after the corresponding intervention measures.Morphological changes of gastric antrum smooth muscle were observed under light microscope.Serum Ghrelin，CCK，5-HT expression was detected by ELISA method，and SCF and c-kit proteins were detected by WB method.Results：1） Morphological and histological changes：Compared with the blank group，the gastric antrum mucosa of the model group was incomplete，the number of blood vessels was reduced，the glands were arranged disorderly，and the number of interstitial cells were reduced.Compared with the model group，the gastric antrum mucosa of the acupuncture group and the western medicine group was basically complete，the glands were arranged neatly，there were abundant blood vessels and a large number of interstitial cells; there was no significant difference in the sham acupuncture group.2） Compared with the blank group，the expression of serum Ghrelin and 5-HT in the model group decreased（P<0.05），CCK and the level of blood glucose increased（P<0.05）.Compared with the model group，the expression of serum Ghrelin and 5-HT increased，the level of CCK and blood glucose decreased in the acupuncture group and the Western medicine group，but there was no significant difference in the expression of Ghrelin，CCK and 5-HT in the sham acupuncture group（P>0.05）.3） Compared with the blank group，the expression of SCF and c-kit protein in the gastric antrum of the model group decreased（P<0.05）.Compared with the model group，the expression of SCF and c-kit protein in the gastric antrum of the acupuncture group and the Western medicine group increased（P<0.05），but there was no significant difference in the expression of SCF and c-kit protein in the gastric antrum of the sham acupuncture group（P>0.05）.Conclusion：The method of mourishing Yuan and dredging the meridians acupuncture can increase the expression of SCF and c-kit protein in gastric antrum of DGP rats，up-regulate SCF-kit signal system，increase the expression of serum Ghrelin and 5-HT，and decrease the expression of serum CCK，so as to improve gastrointestinal motility.

Keywords Acupuncture; Diabetic gastroparesis; SCF/c-kit; Ghrelin; CCK; 5-HT

中图分类号：R245;R245.9+7;R587.2文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.006

糖尿病胃轻瘫（Diabetic Gastroparesis，DGP），又称为糖尿病胃动力障碍，是一种慢性疾病，常以2型糖尿病患者为多见，约占糖尿病患者的50%[1]。DGP是临床上常见糖尿病并发症之一，是以在糖尿病基础上伴有胃动力不足为特征的一种疾病，主要临床表现为腹胀、早饱、厌食、恶心、呕吐、嗳气等一系列消化道症状，严重影响了此类患者的生命质量[2]。因此，找到一种治疗DGP的方法，是当今临床面临的难题。本研究通过腹腔注射链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）建立DGP大鼠模型，以养元通络针法对DGP大鼠进行干预性治疗，以西药组进行对照，观察大鼠胃窦平滑肌形态学改变，以及血清5-羟色胺、胃促生长素（Ghrelin）、胆囊收缩素（CCK）以及胃窦SCF、c-kit蛋白表达，探索“养元通络针法”治疗DGP的相关机制，具有相当重要的学术意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁剂SD大鼠50只，体质量（200±20）g，由湖北省实验动物研究中心提供，动物许可证号：SCXK（鄂）2015-0018。经湖北中医药大学实验伦理委员会批准（伦理审批号：201905-003），将动物饲养于湖北中医药大学实验动物中心，普通饲料，自由饮水。

1.1.2 药物 柠檬酸（广州化学试剂厂，批号：20190806-2）;柠檬酸钠（广州化学试剂厂，批号：20190705-2）;链脲佐菌素（STZ）（Sigma公司，美国，货号：S0130）;盐酸二甲双胍片（中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H20023371）。

1.1.3 试剂与仪器 试剂：酚红试剂（天津恒兴化学试剂公司，货号：SHPBY-50）;Ghrelin（货号：MA1-25658）、CCK（货号：PA5-103116）、5-羟色胺（货号：SE100）;ELISA试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0010）、RIPA裂解液（货号：P0013B）、PMSF（货号：ST506）、WB一抗稀释液试剂盒（货号：45-8199）和GAPDH一抗试剂盒（武汉碧云天生物公司，货号：MA5-15738-D800）;SCF（货号：PA5-19793）、c-kit（货号：44-500G）、一抗试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）;HRP标记羊抗兔二抗（Cell Signaling Technology公司，货号：MA5-15367）;RNase H（货号：PA5-90243）、5×HiScript Buffer（货号：R201-01）试剂（南京诺唯赞生物科技有限公司）。仪器：显微镜（OLYMPUS，日本，型号：BX53）;冰冻切片机（Leica，德国，型号：RM2016）;针灸针（中研太和医疗器械有限公司，型号：0.20 mm×0.25 mm）;电针仪（上海华谊，型号：G6805-2A）;pH计（上海雷磁，型号：E-201F）、血糖仪（强生公司，美国，型号：OneTouch VerioVue）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将动物适应性喂养1周，禁食不禁水12 h，尾静脉取血测空腹血糖，剔除血糖过高大鼠。将50只SD大鼠随机分为空白组（N）、模型组（M）、针刺组（A）、假针刺组（SA）、西药二甲双胍组（MET），每组10只。除空白组外，其余4组均在称重后按55 mg/kg的剂量腹腔注射1% STZ（新鲜配制在4 ℃条件下，0.1 mol/L，pH 4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液[3]），并给予高脂饮食，并于注射后72 h采集鼠尾静脉血测血糖值，选择空腹血糖（FBG）≥16.65 mmol/L的成模大鼠纳入实验[4]。造模过程中，同时测量体质量，并观察大鼠的饮食、大小便、饮水、活动情况、皮毛光泽度及死亡情况等。

1.2.2 干预方法 造模成功2 d后，给予空白组（N）和模型组（M）各灌胃1 mL生理盐水;针刺组（A）针刺脾俞、肾俞、足三里、三阴交（取穴方法参考李忠仁制订的“动物针灸穴位图谱”及解剖学定位）;假針刺组选穴在标准穴位旁开5 mm处，针具选择0.20×25 mm中研太和牌针灸针，针刺深度5 mm，针柄连接华佗电子针灸仪，选用连续波，频率2 Hz，强度1 mA进行干预，单次干预20 min，造模后即开始干预，连续干预2周;西药二甲双胍组（MET）灌胃二甲双胍0.3 g/（kg·d）治疗。

1.2.3 检测指标与方法 各组大鼠于针刺治疗结束后，并禁食24 h、禁水2 h，第2天开始相应指标检测。

1.2.3.1 血清胃促生长素（Ghrelin）、胆囊收缩素（CCK）、5-羟色胺表达的测定 用10%水合氯醛麻醉大鼠后，打开大鼠胸、腹腔，取心尖血，常温静置2 h后，以3 000 r/min，离心半径10 cm，离心10 min后取上清液，按试剂盒方法和步骤，用ELISA法检测血清Ghrelin、CCK、5-羟色胺水平。

1.2.3.2 光镜下观察大鼠胃窦平滑肌形态 采血结束后，迅速剖腹取0.5 cm×0.5 cm大小的胃窦组织。将胃窦部组织块固定、洗涤、脱水及包埋，超薄切片，双重电子染色，在电镜下观察并拍片。

1.2.3.3 胃窦SCF、c-kit蛋白表达的测定 采用Western Blotting法检测胃窦SCF、c-kit的表达水平。取出冻存的胃窦组织，加入RIPA裂解液充分裂解、匀浆、离心提取蛋白，并进行电泳、湿转膜，分别加入一抗、二抗，ECL发光液显色后将膜置于发光体系中检测、显影冲洗保存，同时以GAPDH抗体作为内参，相对表达量用目标蛋白的吸光度值与GAPDH吸光度值的比值来表示。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，治疗前后比较用配对t检验，组间比较用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模后各组大鼠空腹血糖（FBG）比较 与空白组比较，模型组大鼠血糖水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.5）;与模型组比较，针刺组、西药组血糖水平降低，差异有统计学意义（P<0.5），假针刺组差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.2 各组大鼠胃窦平滑肌形态学改变的比较 空白组大鼠胃窦黏膜组织结构完整，血管丰富，腺体的排列整齐，可见较多的间质细胞。与空白组比较，模型组胃窦黏膜不完整，血管数量减少，腺体的排列紊乱，间质细胞数目减少;与模型组比较，针刺组与西药组胃窦黏膜尚完整，腺体排列比较整齐，有较丰富血管，间质细胞数量较多。假针刺组与模型组比较，无明显差异。见图2。

2.3 各组大鼠血清Ghrelin、CCK、5-羟色胺表达比较 与空白组比较，模型组大鼠血清Ghrelin、5-羟色胺表达下降，血清CCK水平升高，差异均有统计学意义（均P<0.05）;与模型组比较，针刺组与西药组血清Ghrelin、5-羟色胺表达上升，血清CCK水平下降，差异均有统计学意义（均P<0.05）;假针刺组Ghrelin、CCK、5-羟色胺表达与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图3～5。

2.4 各组大鼠胃窦SCF、c-kit蛋白表达比较 与空白组比较，模型组大鼠胃窦SCF、c-kit蛋白表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，针刺组与西药组大鼠胃窦SCF、c-kit蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）;假针刺组胃窦SCF、c-kit蛋白表达与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图6～7。

3 讨论

糖尿病胃轻瘫（DGP）是糖尿病患者常见的胃肠动力障碍并发症。近年来的研究表明，Cajal间质细胞（ICC）对于DGP发病的影响不可忽视，已證实ICC是胃肠道运动的起搏细胞，调节神经递质，参与神经冲动的传导[5]。DGP与ICC数量、结构或密度变化有关。ICC表达原癌基因c-kit，其天然配体为SCF，二者组成的SCF/c-kit信号系统，结合并活化酪氨酸激酶，启动一系列磷酸化过程，在ICC的分化、生长、增殖及表型维持中具有重要作用[6]。SCF或者c-kit异常表达以及二者相结合异常，均会导致该通路的传导异常，从而干扰ICC的正常生命活动，以致不能正常的生长、增殖、分化等，影响到胃肠的生理功能[7-8]。Ghrelin是1999年由日本科学家Kojima等发现的，主要由胃底部黏膜X/A样细胞分泌的内源性脑肠肽，进入血液循环[9]。Ghrelin具有多种生物活性，且已被证明具有加快胃肠蠕动、保护胃黏膜、调节胃酸分泌、增强食欲等[10-12]。胆囊收缩素（CCK）是一种肠激素，已知能调节肠内分泌、胆囊收缩和肠蠕动，对肠胃功能有影响[13]。CCK无论在外周或脑内均对摄食和胃肠运动起抑制作用[14]。CCK水平与胃的排空率负相关。研究表明，CCK可通过抑制胃排空，间接降低血糖[15]。5-羟色胺是色氨酸代谢的重要产物，作用于传入神经纤维和迷走神经纤维，与相应受体结合，从而引起胃肠道平滑肌收缩，使胃肠道张力增加，肠蠕动加快[16]。

中医认为，糖尿病胃轻瘫是以消渴为基础的脾胃病，可以将其归为“痞证”“呕吐”“反胃”等范畴[17]。消渴日久，气阴两伤，以致脾胃虚弱。脾不升清，胃不降浊，脾胃运化失司，则生痰饮、食积、湿热、气滞等[18]。所以糖尿病胃轻瘫属本虚标实之证[19-20]。“养元通络”是彭锐教授针法的核心思想，脊柱与四肢取穴相结合，从背腧穴（五脏六腑之元气输注于腰背部的穴位）入手，治疗DGP取脾俞、肾俞，以养护脾胃之元气，补虚泻实，以补为主;再取四肢部足三里、三阴交穴以疏通经络，补虚泻实，以泻为主。诸穴合用，达到经络通畅，元气充沛，标本兼治的效果。“养元通络针法”已在临床上验证了其在治疗胃动力不足方面的疗效，为进一步探讨该疗法对糖尿病胃轻瘫的疗效和作用机制，故展开本实验研究。

本实验结果表明，DGP模型大鼠血糖较正常组升高，胃窦SCF、c-kit蛋白表达降低，胃窦黏膜组织较正常组不完整，血管数量减少，腺体的排列紊乱，间质细胞数目减少，血清Ghrelin、5-羟色胺表达较正常组明显减少，CCK表达较正常组升高，提示SCF/c-kit信号通路传导途径表达下调、活性被抑制与DGP胃动力不足有一定相关性。干预2周后，针刺组和西药组大鼠较模型组血糖下降，胃窦SCF、c-kit蛋白表达升高，胃窦黏膜组织比模型组完整，腺体排列整齐，血管丰富，间质细胞数量多，血清Ghrelin、5-羟色胺表达增加，血清CCK表达下降，表明养元通络针法能提高SCF/c-kit信号通路的活性，达到改善胃肠动力的作用，并且还能使血糖下降。但是，这一过程涉及的机制十分复杂，还需要进一步深入研究。

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（2020-03-11收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：湖北省卫生健康委联合基金立项项目（WJ2019H409）;武汉市卫生健康委中西医结合重点项目（WZ19A02）

作者简介：王峰（1996.12—），男，硕士研究生在读，研究方向：中医药防治骨与关节疾病的研究，E-mail：984627415@qq.com

通信作者：彭锐（1967.12—），男，博士，教授，主任医师，博士研究生导师，研究方向：骨与关节的中西医防治研究，E-mail：974831374@qq.com