离子色谱法测定牛肉中亚硝酸盐含量的不确定度评定

孙 丽，刘 蔷

(淮安市食品药品检验所，江苏 淮安 223300)

亚硝酸盐作为防腐剂和着色剂被允许用于肉制品的生产加工，可为肉制品保鲜增色。亚硝酸盐对人体的危害已得到广泛重视，科研工作者已开展多种途径减少和消除亚硝酸盐的研究，并取得了一定的成果[1-4]。亚硝酸盐每日允许摄入量(ADI)为0～0.07 mg/kg.BW[5]，若过量摄入会对人体健康造成许多不利影响。亚硝酸盐对人体的危害主要有两方面：一是亚硝酸盐本身的毒性，可引起高铁血红蛋白症，使血液失去携带氧气的功能，从而使人出现缺氧中毒症状，严重时还会因呼吸衰竭而危及生命[6]；二是亚硝酸盐还会在人体内与二级胺反应生成亚硝胺[7]，而亚硝胺可以引发肝癌、食管癌、胃癌等多种癌症[8-10]。因此控制肉制品中的亚硝酸盐含量对食品安全意义重大。

为评定亚硝酸盐检测结果的准确性，实验室通常采用不确定度进行说明。本文依据测量不确定度评定准则[11-14]，采用规范方法，对样品中亚硝酸盐含量进行测定，建立了离子色谱法测定酱卤肉制品中亚硝酸盐的不确定度评定方法，通过分析不确定度的来源，寻找影响检测结果的关键因素，为提高亚硝酸盐的检测水平提供了参考依据，对保护人们的生命健康具有至关重要的意义。

1 实 验

1.1 仪器设备

戴安ICS-5000+离子色谱仪，戴安公司；XS205DU电子天平，METTLER TOLEDO公司；MULTIFUGE-X1R高速冷冻离心机，ThermoFisher仪器有限公司；KH7200DE超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；GenPure Pro超纯水机，ThermoFisher；刻度吸量管，1 mL，5 mL；单标线吸量管，1 mL，2 mL；容量瓶，20 mL，100 mL。

1.2 标准品

亚硝酸盐标准溶液：国家有色金属及电子材料分析测试中心。

1.3 测定方法

依据GB 5009.33-2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》。

1.4 标准曲线制备

用1 mL移液管移取1 mL 1000 mg/L亚硝酸盐标准溶液到100 mL容量瓶中得10 mg/L标准中间液。

表1 标准曲线配制Table 1 Standard curve preparation

1.5 样品测定液的制备

样品经粉碎至匀浆，称取试样5 g置于150 mL具塞锥形瓶中，加入80 mL水， 超声提取30 min，每隔5 min振摇1次，保持固相完全分散。于75 ℃水浴中放置5 min，取出放置至室温，定量转移至100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于10000 r/min离心15 min，上清液备用。

取上述备用溶液约15 mL，通过0.22 μm水性滤膜针头滤器、C18柱，弃去前面3 mL，收集后面洗脱液待测。固相萃取柱使用前需进行活化，C18柱、Ag柱和Na柱,其活化过程为：C18柱使用前依次用10 mL甲醇、15 mL水通过，静置活化30 min。Ag柱和Na柱用10 mL水通过，静置活化30 min。同时做空白试验。

1.6 数学模型的建立

式中:X——亚硝酸盐的含量，mg/kg

C——上机液中亚硝酸盐含量，mg/L

V——样品定容体积，mL

m——样品质量，g

1.5——亚硝酸根离子换算为亚硝酸盐(按亚硝酸钠计)的折算系数

2 结果与讨论

2.1 不确定度的分析与评定

2.1.1 标准曲线拟合引起的不确定度urel(c0)

表2 标准曲线拟合计算结果Table 2 Standard curve fitting calculation results

配制的标准曲线溶液，每一浓度测定2次，以亚硝酸盐的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得出的线性方程为y=0.4746x-0.0028，相关拟合系数(r)为0.9999，斜率(b)为0.4746，截距(a)为-0.0028。对同一样品进行了2次测量，浓度平均值为1.09 mg/L。

对C0进行2次测定，由吸收率通过直线方程求得C0=1.09 mg/L，则C0的标准不确定度为：

2.1.2 标准溶液配置引入的相对不确定度urel(c标)

2.1.2.1 标准溶液引入的不确定度urelp

2.1.2.2 标准中间液配置引入的不确定度urelmed

将储备液1000 mg/L按1:100，得到10 mg/L的标准中间液。1:100稀释是采用1 mL单标线吸量管和100毫升容量瓶来完成，对1 mL单标线吸量管和100 mL容量瓶进行不确定度分析。

温度波动引起的1 mL单标线吸量管引入的不确定度为：

温度波动引起的100 mL容量瓶引入的不确定度为：

结合(1)(2)(3)中间液合成相对不确定度urelmed

2.1.2.3 获得标准工作液引入的相对标准不确定度urelw

表3 吸量管和容量瓶[15-17]引入的不确定度Table 3 Uncertainty introduced by pipette and volumetric flask

根据表3各分量相对标准不确定度结果，求得标准溶液浓相对标准不确定度：

=0.0074

综上，标准溶液浓度引入不确定度

=0.0089

2.1.3 样品制备过程中产生的不确定度urel(c样)

2.1.3.1 样品称重引起的不确定度urel(m样)

该天平称量时重复性最大允许误差为1.0 e，即1.0 mg，重复性产生的不确定度：

单次称量的标准不确定度：

天平秤量两次：

样品称量的相对标准不确定度为：

urel(m样)=u(样)/m样=0.912/5002.6=0.000182

2.1.3.2 样品定容引起的不确定度urel(V)样

结合(1)、(2)样品定容带来的不确定度：

综上，样品制备时产生的不确定：

2.1.4 重复测定引入的不确定度urel(rep)

样品平行测定7次，测定结果分别为1.098、1.029、1.066、1.085、1.072、1.091、1.089 mg/L，平均值1.076 mg/L，标准偏差Srep=0.0234 mg/L，正常测定2次。

2.1.5 合成相对不确定度

各合成不确定度分量列表，见表4。

表4 相对不确定度汇总表Table 4 Summary table of relative uncertainty

各相对不确定度进行合成：

=0.062

2.2 测试结果及不确定结果的表述

牛肉中亚硝酸盐含量为32.28 mg/kg，因此，

u(c)=32.28×0.062=2.0 mg/kg

95%包含概率下包含因子K=2，扩展不确定度为：

U=K×u(c)=2×2.0=4.0 mg/kg

牛肉中亚硝酸盐含量为：

C=(32.3±4.0) mg/kg,K=2

3 结 论

本文采用GB 5009.33-2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》建立离子色谱法对牛肉中亚硝酸盐含量进行测定。通过对校准曲线拟合、标准溶液的配制、样品的制备、测试重复性四个方面进行不确定度评定，牛肉中亚硝酸盐不确定度贡献主要来源于标准溶液配制，特别是标准工作液对不确定度影响较大。因此，在实验过程中为获得准确的测定结果，配制标准曲线溶液的时候，各个标曲点正确配制，并做到规范操作，减小曲线配制过程中产生的不确定度，消除误差，以保证测量结果有更高的准确度。