苹果Md LAC基因家族成员的鉴定与序列分析

杨 阳，刘媛媛

（1.吕梁学院 生命科学系，山西 吕梁 033000；2.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801）

漆酶（Laccase,LAC）是多铜氧化酶较大的亚家族之一，能结合多个铜离子。LAC具有广泛的底物，如氧化双酚、氨基或甲氧基取代的单酚、芳香二胺和羟胺组分等[1-3]。典型的LAC含有3个保守结构域:N端和C端以及双核铜离子中心位点（CuA和CuB）。其中，CuA位点的氨基酸保守性较CuB位点强[4]，可以结合4个铜离子。LAC普遍存在于细菌[5]、真菌[6]和动植物[7]中。在不同的物种中，LAC发挥不同的功能，如参与伤口愈合和木质素生物合成[8-11]，提高植物对酚酸类物质的抗性[12-14]及对黄萎病的抗性[15]。

苹果是世界范围内广泛种植的园艺作物，在干旱、盐碱等非生物胁迫下，其产量和品质均受到一定的影响。因此，苹果在各种胁迫下的抗性研究成为热点。目前，对苹果基因家族的鉴定研究报道很多，但未见有苹果漆酶（MdLAC）基因家族的报道。为此，对苹果MdLAC基因家族成员进行理化性质、基因结构、多序列比对、染色体定位和系统进化树分析，为研究苹果MdLAC基因家族生物功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 苹果Md LAC基因家族成员的鉴定、理化性质及染色体定位分析

苹果基因组和蛋白质组数据均下载于蔷薇科基因组网站GDR（http：//www.rosaceae.org）。拟南芥LAC蛋白质组数据下载于拟南芥网站（TAIR，http://www.arabidopsis.org），梨[16]（Pyrus bretschneideri）、苔 藓（Physcomitrella patens）LAC蛋白质组数据下载于NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）。通过在线软件Pfam（http://pfam.xfam.org/）下载LAC基因隐马尔可夫模型（PF07731、PF00394、PF07732），利用HMMER软件搜索苹果蛋白质组中LAC蛋白序列，利用SMART（https://smart.embl-heidelberg.de/）软件网站对初步筛选得到的候选基因家族成员的结构域进行验证，最终确定苹果MdLAC基因家族成员。利用在线软件ExPASy（https://www.expasy.org/）对苹果MdLAC基因家族成员进行理化性质分析，应用在线软件CELLO（http://cello.life.nctu.edu.tw/）进行亚细胞定位预测，采用在线软件MapGene2Chromosome 2.0(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)进行染色体定位分析。

1.2 苹果Md LAC基因家族成员系统进化分析

利用MEGA软件和在线工具iTOL（https://itol.embl.de/）对鉴定的MdLAC蛋白序列、18个AtLAC蛋白序列、45个PbLAC蛋白序列和4个PpLAC蛋白序列，采用邻近法（Bootstrap设置为1 000），构建系统进化树。

1.3 苹果Md LAC基因家族成员基因结构、保守基序分析

利 用 在 线 软 件GSDS（https://itol.embl.de/）分 析MdLAC基因结构，采用在线软件MEME(http://meme-suite.org/)和TBtools软件分析保守结构域。

1.4 苹果Md LAC氨基酸序列比对

利用DNAMAN软件对苹果MdLAC蛋白序列进行氨基酸多序列比对。

2 结果与分析

2.1 苹果Md LAC基因家族成员的鉴定及染色体定位分析

通过HMMER和SMART软件筛选，在苹果中共鉴定到77个MdLAC基因家族成员，根据在染色体的位置将其命名为MdLAC1—MdLAC77（表1）。对苹果MdLAC基因家族成员进行氨基酸序列长度、分子质量及等电点预测分析，结果表明，77个MdLAC蛋白氨基酸序列长度在323～611，分子质量大小在36.29～67.87 ku，等电点（pI）在4.65～9.92，多数蛋白质等电点大于7，说明该基因家族成员大多数为碱性蛋白质。亚细胞定位分析表明，大部分MdLAC蛋白定位在细胞外和细胞质，少量定位在外膜上，表明MdLAC蛋白家族成员在不同的微环境下功能不同[17]。有的蛋白质定位不止在1个位置，也进一步说明了这些蛋白质可能具有多重功能。与前人对大白菜LAC蛋白相关功能的报道，定位在胞外的LAC主要参与木质素合成和细胞壁的形成，而定位在细胞质的LAC主要参与大白菜芝麻状斑点病的发生过程[18]。

表1 苹果Md LAC基因家族成员信息Tab.1 The information of Md LAC family members in apple

续表1 苹果Md LAC基因家族成员信息Tab.1（Continued）The information of Md LAC family members in apple

续表1 苹果Md LAC基因家族成员信息Tab.1（Continued）The information of Md LAC family members in apple

从图1可以看出，MdLAC基因家族成员不均匀地分布在苹果18条染色体上，其中，Chr08、Chr09、Chr14和Chr17上只有1个基因分布，分别是MdLAC43、MdLAC44、MdLAC67和MdLAC77；Chr06和Chr16上各有2个基因，分别为MdLAC32、MdLAC33和MdLAC75、MdLAC76；Chr11上分布MdLAC50—MdLAC59，为18条染色体上分布最多的，占全部MdLAC基因的13%；Chr03上分布6个基因（MdLAC13—MdLAC18），位于染色体的上端，同样的现象也出现在Chr11；有6个MdLAC基因（MdLAC4—MdLAC9）定位在Chr01上，位于染色体的末端；此外，有8个MdLAC基因（MdLAC34—MdLAC41）定位在Chr07的末端。

图1 苹果Md LAC基因家族成员染色体定位Fig.1 Chromosome location of Md LAC gene family members in apple

2.2 苹果Md LAC基因家族成员系统进化树分析

将鉴定到的77个苹果MdLAC蛋白构建系统进化树，并根据拟南芥AtLAC基因功能对其进行分组（图2）。从 图2可 以 看 出，MdLAC34、MdLAC49、MdLAC77等30个MdLAC基因和拟南芥AtLAC6、AtLAC8聚为一支。AtLAC8会影响植物开花时间[19]，AtLAC6在生物胁迫下表达量会下调[20]，推测这支MdLAC基因可能与植物开花时间和生物胁迫有关。MdLAC3、MdLAC12、MdLAC74与 拟 南 芥AtLAC15、AtLAC16聚为一支。拟南芥AtLAC15主要负责类黄酮物质的合成[21]，据此推测，该支中的苹果MdLAC74、MdLAC1、MdLAC12等MdLAC基因同样具有合成类黄酮的作用。拟南芥AtLAC4、AtLAC11和AtLAC17基因在影响细胞壁木质化和调控木质素单体上有重要作用[22]，推测该支中的苹果MdLAC基因具有类似的功能。AtLAC5、AtLAC13基因对ABA信号途径有响应[23]，由此推测，苹果MdLAC23、MdLAC76、MdLAC62、MdLAC63、MdLAC24、MdLAC25、MdLAC15、MdLAC53、MdLAC52、MdLAC38、MdLAC5、MdLAC6、MdLAC39基因可能通过响应ABA信号途径增强苹果对非生物胁迫下的逆境抗性。

图2 苹果Md LAC基因家族成员系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of Md LAC gene family members in apple

2.3 苹果Md LAC基因结构、保守基序分析

从图3可以看出，MdLAC基因的UTR个数最多不多于2个，部分MdLAC（MdLAC3、7、30、33、35、36、53、61、63、71、76）基因无UTR，所有基因的CDS个数在2～10个，其中，24个MdLAC基因具有6个CDS，19个MdLAC基因具有5个CDS，只有MdLAC59基因具有10个CDS，4个MdLAC基因（MdLAC7、13、51、62）有2个CDS，其他MdLAC分别含有3、5、7、8、9个CDS。

图3 苹果Md LAC基因家族成员基因结构分析Fig.3 Gene structure analysis of Md LAC gene family members in apple

为了进一步阐明MdLAC基因家族的结构特征，对苹果MdLAC基因家族成员的保守基序进行分析，结果显示，在基因进化上,MdLAC基因进化结果与其Motif组成和位置分布较为一致（图4）。MdLAC基因中，Motif 1最为保守，共由41个氨基酸位点组成，在第2、11、19、28、32位为保守氨基酸位点，对应残基分别为天冬酰胺、苏氨酸、色氨酸、天冬酰胺和色氨酸。

图4 苹果Md LAC基因家族Motif结构（A）、基因进化（B）及Motif组成（C）分析Fig.4 Analysis of Motif structure（A），gene evolution（B）and Motif composition（C）of Md LAC gene family in apple

77个MdLAC基因中，Motif 1、Motif 2、Motif 4、Motif 6、Motif 8、Motif 9、Motif 10相对保守，其中，Motif 4一般位于最前端，Motif 9一般位于末端，MdLAC75明显缺失Motif 6、Motif 7、Motif 1、Motif 9、Motif 3和Motif 10，而MdLAC48只含有Motif 8、Motif 5和Motif 1，MdLAC71虽然含有大多数Motif，但Motif位置与其他MdLAC位置不同。

2.4 苹果Md LAC氨基酸序列比对

从图5可以看出，苹果MdLAC含有LAC保守结构域，且位置相对一致，氨基酸序列差异不大，共有3个保守结构域位点，分别为G、P、W。

图5苹果Md LAC氨基酸序列比对Fig.5 Comparison of amino acid sequences of Md LAC in apple

3 结论与讨论

LAC以基因家族的形式存在于植物中，且成员众多，功能具有多样性[7]。目前，已在多种植物中对LAC基因家族成员进行鉴定，如大白菜[18]中15个、狗尾草[24]中52个、龙眼[25]中42个等。陆地棉中，过表达GhLAC15基因会增加木质素的合成，提高植株的抗病性[26]。在拟南芥中，BARROS等[3]和POURCEL等[27]研究证明，AtLAC15具有双重功能，可以催化类黄酮和单甘醇的聚合。LIU等[28]研究水稻LAC时发现，OsLAC10和木质素生物合成及非生物胁迫响应均有关。研究表明，在高等植物中，LAC基因的表达除受环境等影响外，还会受到转录因子和miRNA的调控[29]。LU等[30]研究发现，在不同组织部位中PtLAC的表达与转录因子的调控作用有关。

本研究对苹果MdLAC基因家族进行鉴定，共得到77个家族成员，编码的氨基酸序列长度在323～611，部分MdLAC蛋白定位在细胞外，属于分泌蛋白；其他MdLAC蛋白在细胞质、内膜和外膜上也有定位。将苹果MdLAC基因、梨PbLAC基因、拟南芥AtLAC基因和苔藓PpLAC基因共同构建系统进化树，同时将苹果MdLAC基因家族成员进行分组发现，其中一支包括4个 苔 藓PpLAC基 因（PpLAC1、PpLAC2、PpLAC3、PpLAC4），这4个基因的存在证明苹果基因组中保留了古老的基因重复，但LAC基因的普遍性和多样化应该发生在苔藓-裸子植物分化之后[31]。

近年来，苹果在各种胁迫下相关的抗性基因陆续被鉴定[32-35]。本研究利用生物信息学方法对苹果MdLAC基因家族成员进行鉴定及多序列分析，以期为后续苹果MdLAC基因的功能研究提供思路,为提高苹果抗性研究提供方向。