硒对奶牛乳腺氧化应激及炎症反应的调控作用及其机制

郭咏梅 闫素梅

(内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古自治区高校动物营养与饲料科学重点实验室，呼和浩特 010018)

随着奶牛产奶性能的不断提高，乳腺代谢率相应增加，尤其在围产期和泌乳高峰期，旺盛的代谢导致短时间内产生大量的自由基超过了机体的清除防御能力，进而诱发氧化应激及失调性炎症反应，这对于高产奶牛尤为严重。乳腺细胞的氧化损伤和降低的抗氧化机能不仅影响了动物的福利，而且甚至降低了乳产量和乳品质，给奶牛养殖业造成巨大的经济损失[1]。体内与体外的大量研究表明，硒可以有效减缓奶牛氧化应激及炎症反应，从而改善健康状况，降低发病率，促进乳蛋白的合成[2-4]。研究发现，硒的抗氧化功能是通过调节硒蛋白来实现的，主要包括谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)及硫氧还蛋白还原酶(TrxR)家族；硒蛋白可以通过调节细胞内信号通路从而调节机体氧化与抗氧化之间的稳态平衡[5]。因此，本文从硒蛋白及其对相关信号通路的调控角度总结硒缓解奶牛氧化应激、调节免疫应答的机制，有助于构建更加合理的营养策略，减缓代谢性疾病，改善奶牛健康。

1 氧化应激及炎症反应的产生

氧化应激水平增加是诱导奶牛乳腺炎症反应和免疫功能障碍的主要因素。研究发现，处于围产期或泌乳前期的奶牛乳腺氧化应激水平升高，促炎细胞因子的基因表达显著提高[16]；而中性粒细胞L-选择蛋白的基因表达显著降低[17]。大量的ROS可诱导奶牛肺泡细胞产生氧化应激，并通过信号转导进一步促进炎症生物标志物环氧合酶-2(COX-2)的表达[18]，这说明增加的氧化应激水平介导了细胞的炎症反应。温和的炎症反应对于免疫是必需的，但促炎细胞因子的过度表达通常会诱发病理学促炎反应的发生[16]。临产前后奶牛氧化应激水平较高时，中性粒细胞的呼吸爆发能力、吞噬作用、迁移速率均显著降低[19]。机体免疫系统的失衡引起炎症反应加强，更易诱发氧化应激，最终形成恶性循环。

2 硒对奶牛氧化应激及炎症反应的调节作用及其机制

2.1 对奶牛氧化应激与炎症反应的调节作用

机体具有周密的抗氧化系统，可以中和、代谢并延迟氧化物的产生。抗氧化剂包括内源性酶，如GPx、TrxR、过氧化氢酶(CAT)及血红素加氧酶(HO)等。此外，非酶促抗氧化剂也是发挥抗氧化作用的重要部分，包括饲粮来源的微量矿物质(硒、铜、锌)、多酚、维生素(A、C、D和E)以及维生素A前体物β-胡萝卜素[20]。酶和非酶抗氧化剂协同保护细胞免受自由基诱导的氧化损伤。硒是重要的饲粮抗氧化剂来源，可以通过直接的抗氧化作用以及增强免疫力来有效对抗氧化应激，进而预防奶牛疾病的发生[21]。研究表明，单独补加硒可以降低产犊期奶牛乳房炎症感染率并减少含较高体细胞数的乳区比例[22]，改善泌乳中期奶牛血液及牛奶中抗氧化及免疫指标[4]。Warken等[23]给予围产期奶牛亚硒酸钠肌肉注射后发现，牛奶体细胞数及ROS含量下降，SOD活性显著升高，缓解了奶牛氧化应激。体外研究也得出了类似的结果，硒可以促进BMEC的抗氧化功能，SOD、GPx、TrxR、CAT等抗氧化酶活性升高，减缓了过量自由基诱导的氧化应激[4,24]，但其机制并不清楚。

2.2 减缓奶牛氧化应激与炎症反应发生的机制

2.2.1 通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ/核因子相关因子E2(PPARγ/Nrf2)上调硒蛋白酶的表达

作为硒蛋白酶的组成成分，硒可以调节硒蛋白酶的活性，进而保护机体组织免受氧化损伤，调节抗氧化与免疫功能等；其中，TrxR和GPx是奶牛相关研究较多的与抗氧化有关的硒蛋白。Weiss[25]总结发现，硒或酵母硒可以显著提高红细胞中GPx的活性，改善奶牛抗氧化功能。Guo等[8]研究也发现，硒代蛋氨酸可以促进BMEC的生长并上调硒蛋白TrxR1及GPx1基因及蛋白的表达。Nrf2是对氧化还原反应敏感的转录因子，控制编码多种抗氧化及细胞保护相关蛋白的基因转录，如GPx、TrxR、HO、SOD等酶的合成。正常生理状态时，Nrf2被锚定在细胞浆内处于抑制状态；发生氧化应激时，Nrf2移位入细胞核，启动下游抗氧化基因及一系列Ⅱ相解毒酶的转录，从而发挥强大的抗氧化作用[26]。Gessner等[27]研究表明，从奶牛妊娠后期到泌乳启动的过渡时期，由于抗氧化活性降低，激活内源性调节，导致Nrf2靶基因的表达上调，促进了抗氧化酶的表达，以提高机体的抗氧化能力。奶牛肝脏中的未折叠蛋白反应在这个时期被激活，导致Nrf2通过蛋白激酶R样内质网激酶通路被激活[28]，从而促进了抗氧化酶的表达并提高了抗氧化能力。这种内源性调节机制可能也解释了过多的抗氧化剂补充反而会损害抗氧化能力的事实[26]，大量抗氧化剂可能通过过度抑制Nrf2激活损害机体抗氧化能力。本课题组的研究结果也表明，在氧化应激条件下，添加硒可以激活Nrf2的表达，从而上调其下游TrxR等抗氧化酶的表达，抑制NO诱导的BMEC氧化损伤及炎症反应[14]。

PPARγ不仅是乳脂调控的重要转录因子，对奶牛氧化应激与炎症反应也起到了良好的保护调控作用。研究表明，PPARγ可以调节Nrf2，小鼠肺部Nrf2的表达在PPARγ抑制后显著下降[29]。补加硒可以显著增加BMEC内PPARγ与Nrf2的表达，但PPARγ的抑制降低了Nrf2的基因表达，降低了TrxR、SOD和CAT等抗氧化酶的活性，iNOS活性和炎症因子的含量呈相反的变化趋势，因此降低了抗氧化功能；而且当PPARγ被抑制，硒对NO过量诱导的细胞氧化应激的预保护作用被抑制[30]。因此，硒可以通过调控PPARγ/Nrf2进而对机体起到良好的抗氧化保护作用。

2.2.2 通过PPARγ/GPx-核转录因子-κB(NF-κB)抑制过量NO的生成

NF-κB是参与免疫功能调控的重要信号通路，受到细菌、ROS、LPS等因素的刺激，NF-κB上的p65亚基就会与抑制蛋白解离，并经移位后进入到细胞核中，与靶基因上的相应位点结合[31]。研究表明，脂多糖(LPS)显著诱导BMEC中NO的过量产生，并激活了NF-κB信号通路[32]；然而，硒的添加显著抑制了LPS诱导NF-κB的核转录，降低了NO及促炎因子的产生[33]。石惠宇[32]发现，添加白细胞介素-1(IL-1)受体拮抗剂可以抑制BMEC中iNOS的表达和NO的释放，说明了白细胞介素-1β(IL-1β)对NO过量释放的介导作用。过量NO诱导的奶牛外周血单个核细胞的氧化应激引起NF-κB通路磷酸化水平增强，上调了肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6和IL-1β等细胞因子的基因与蛋白表达，而IL-1β的释放可以介导iNOS的表达，进而引起氧化应激[34]；核转录因子-κB p65(NF-κB p65)沉默后，iNOS的表达显著下降，促进了细胞抗氧化应激能力，降低了炎症因子的产生[35]。硒添加通过增强全血GPx1的活性缓解了母牛的炎症反应[23]。硒蛋白如TrxR和GPx可调节炎症反应相关信号通路，进而抑制不可控炎症诱发的免疫病理过程。研究发现，BMEC中GPx1的过表达可以下调NF-κB p65活性及核易位，抑制其磷酸化激活[32]。相反地，GPx1基因沉默后，激活了BMEC中NF-κB信号通路，增加了下游炎症因子的活性及基因表达量，iNOS活性及其基因表达与NO的生成量增加，细胞的抗氧化功能降低[30]。NF-κB信号通路的活化及核转录也可以通过过表达GPx4进行抑制[36]。这些研究结果说明，硒通过GPx-NF-κB减缓了奶牛乳腺氧化应激及炎症的发生。NF-κB通路还受到PPARγ的调节，当PPARγ被抑制，NF-κB信号通路激活，下游IL-1β等炎症因子及iNOS表达量升高，NO含量增加，导致氧化应激水平升高；然而，硒的添加逆转了上述氧化损伤，这说明硒通过PPARγ/GPx-NF-κB抑制了过量NO的生成，减缓了奶牛乳腺氧化应激的发生[30]。

2.2.3 通过TrxR-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/NF-κB途径抑制过量NO的生成

TrxR、Trx及NADPH构成了硫氧还蛋白系统[5]，其中Trx具有氧化型(Trx-S2)和还原型[Trx(SH)2]2种形式，其氧化还原调节功能是通过二硫键和巯基的互变来实现的[37]。研究发现，补充有机硒可增强奶牛血液中硒蛋白TrxR的活性[4]，上调BMEC中TrxR的基因表达及其酶活性，抑制LPS诱导的BMEC内TNF-α、IL-1、白细胞介素-6(IL-6)的蓄积[38]。研究表明，TrxR1活性受到抑制后，iNOS的蛋白表达显著增加，其活性也伴随增加，进而诱导NO的过量产生[39]，并进一步转化为毒性更强的过氧亚硝酸阴离子(ONOO-)[40]。siRNA靶向沉默TrxR基因表达试验也进一步说明了硒蛋白TrxR对BMEC及奶牛内皮细胞过氧化损伤的保护作用[39,41]。这提示硒通过促进TrxR活性下调了下游炎症因子及NO的过量产生。

MAPK家族包括p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)，也是重要的与氧化还原密切相关的通路。H2O2、细胞因子及其他应激因素导致的激活蛋白-1的激活主要受到JNK及p38MAPK通路的调节[42]。细胞凋亡信号激酶-1(ASK-1)是MAPK信号通路的中间体，可以激活下游促炎症和促凋亡细胞信号级联，哺乳动物Trx(SH)2是ASK-1激酶的活性抑制剂，也是依赖ASK-1表达的基因的负调节因子[43]，两者之间具有高度的依赖性。Trx(SH)2与ASK-1的N端区域结合，抑制其活性，当BMEC发生氧化应激时，TrxR活性下降，ASK-1被激活，进而导致p38MAPK和JNK磷酸化，通路活性被激活[16]。MAPK信号通路的激活可以进一步诱导NF-κB通路的活化，进而促使IL-1β等炎症因子的大量产生，导致NO等自由基的大量释放；过量释放的自由基反过来又诱导MAPK信号通路的激活，并刺激NF-κB的进一步活化，形成恶性循环，最终诱发不可控的炎症反应，导致机体损伤[44]。然而，硒的添加可以抑制金黄色葡萄球菌或过量NO诱导的BMEC内p38MAPK、JNK、ERK1/2以及NF-κB的激活，进而下调炎症因子的表达[14,45]。研究表明，SB203580、SP600125分别抑制了由DNCB引起的p38MAPK、JNK信号通路的磷酸化水平的升高，抑制了其通路活性，IL-1的生成及其基因表达显著下降，降低了NO的生成；相反，过表达TrxR1基因显著降低了p38MAPK、JNK通路的基因表达与磷酸化水平及其下游IL-1β和iNOS的基因与蛋白表达，减缓了NO诱导的氧化损伤[39]。这些研究结果进一步说明，硒通过促进TrxR1的表达，抑制了MAPK信号通路的激活，减缓了NO诱导的细胞氧化损伤。

2.2.4 通过TrxR-MAPK/硒蛋白-LOX/COX调节ARA

ARA的大量释放也与细胞氧化应激密切相关。ARA通常以磷脂的形式存在于细胞膜上，在磷脂酶C、磷脂酶A2(PLA2)2种酶的催化作用下，分解为游离的ARA[46]。研究发现，二硝基氯苯抑制TrxR活性后，MAPK信号通路中ASK-1的活性及其下游p38MAPK和JNK的磷酸化水平显著加强，通路下游底物cPLA2被磷酸化激活，促进了ARA的释放，过多的ARA会诱导BMEC中ROS的蓄积[47]。而硒的添加使BMEC中TrxR活性显著升高，逆转了二硝基氯苯诱导的氧化应激及对TrxR的抑制作用，Trx(SH)2与ASK-1结合阻碍了MAPK通路的进一步激活及下游cPLA2诱导的ARA及其相关代谢产物在BMEC中的过量蓄积[47]。ARA经LOX、COX、细胞色素P450单氧化酶、非酶氧化4条途径分别代谢生成不同的具有生物活性的代谢产物，包括前列腺素、血栓素A2、白三烯等[48]。5-LOX和白三烯A4水解酶是ARA代谢产生类花生四烯酸的2个限速酶，硒可以下调上述2个限速酶进而减少类花生酸类物质的产生，从而降低其促炎作用[49]。某些硒蛋白，如GPx1、GPx4可以调节COX/LOX的表达，进而有效控制细胞内氧化还原状态[50-51]。因此，硒还可以通过调节硒蛋白的表达调节ARA的代谢，以缓解氧化应激。

3 小 结

本文从硒蛋白、Nrf2、MAPK及NF-κB信号通路4个方面论述了硒对奶牛乳腺氧化应激及炎症反应的缓解作用及其机制。从妊娠到泌乳的过渡期，奶牛需要适应机体快速代谢，在饲粮中补加硒是奶牛代谢需求增加时增强抗氧化防御机制及免疫功能并维持健康的重要手段。然而，对于多种硒蛋白及其他中间硒代谢物在乳腺氧化应激反应和宿主免疫中的作用以及信号通路间的相互作用知之甚少，还需要进一步探究。