基于指纹图谱技术的饲料营养活性物质结构-谱-量-效关系的研究进展

熊安然 熊本海 蒋林树*

(1.北京农学院动物科学技术学院，奶牛营养学北京市重点实验室，北京 102206；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

饲料中蛋白质、脂肪、碳水化合物等基本营养素因其结构清晰、功能明确，已经全面应用于畜禽的饲粮配方，有力地促进了我国畜牧产业的快速发展[1]。但随着畜禽养殖环保压力日益增大和人民对高品质畜产品需求的不断增加，绿色健康养殖成为我国畜牧业发展的必然趋势。农业农村部公告第194号规定，自2020年1月1日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种[2]。饲料营养活性物质所具有的激活动物自身免疫机能、提高体内抗氧化活性和饲料报酬等功能成为后抗生素时代实现畜禽健康养殖的重要技术策略。卢德勋于2004年首次提出了饲料营养活性物质组学理论，随后进一步提出一套完整的关于健康养殖的营养技术策略的技术体系，认为科学利用饲料营养活性物质是畜禽减抗、健康养殖的重要核心环节[3-5]。陈代文等[6]也在2005年提出了“抗病营养”的理论和技术体系，从动物免疫力的角度证明了科学的营养策略是保障动物健康生产和预防疾病的根本技术手段[7]。因此，具有促进肠道健康、维持免疫和氧化平衡以及调节基因表达等特殊营养调控或保健功能的饲料营养活性物质成为解决畜禽健康养殖的重要技术途径[7]。

2018年国家将甘草、黄芩等共117种天然植物列入饲料原料目录[8]。2019年国家发布了《天然植物饲料原料通用要求》[9]，这些药食同源特性的天然植物被列入饲料原料目录以及国家相关标准的出台，为推动饲料中的营养活性物质的研究奠定了重要基础。但因饲料营养活性成分结构复杂、主效因子不明确，受产地来源、收获季节、使用部位、加工方式的影响[10]，其分子结构、种类也各有不同[7]，使研究与应用滞后于产业发展的要求[7]。指纹图谱技术将饲料中的营养活性物质所包含的化学信息通过图谱的形式进行分析并加以描述，从而获得饲料中营养活性物质主效成分或有效成分[11-12]，进而结合其代谢途径、生物学功能等相关研究为饲粮的精准营养和精准配方提供数据支撑[7]。本文系统分析了饲料营养活性物质结构、含量、图谱、功效等关系，以期为饲料营养活性物质在畜牧生产中的广泛应用和探索构建基于营养活性物质的饲料质量评价体系提供理论依据及技术支撑。

1 饲料营养活性物质研究的技术基础

饲料中的营养活性物质可分为类胡萝卜素、有机酸类、寡糖类、酶类、磷脂、脂肪酸类、多酚和调味剂共8类[1]。指纹图谱技术可根据物质的不同特性实现对营养活性物质的分离、定性和定量分析[7]。根据特定波长下吸光度不同，利用红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)等光谱技术可以实现对活性成分进行分离；根据处于强磁场中的原子核对射频辐射的吸收差异，采用核磁共振(NMR)可以获得有关化合物分子结构信息的分析方法[13]；根据不同的物质在固定相和流动相之间的分配不同，利用高效毛细管电泳(HPCE)、薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)等色谱技术使待分离物质分子中的不同组分在固定相上相互分离[14]；根据带电离子在电场和磁场中的质荷比不同，利用质谱(MS)对其分离之后进行检测，可以获得化合物的分子质量、化学结构、裂解规律和由单分子分解形成的某些离子间存在的某种相互关系等信息[15]。色谱、光谱及NMR、MS等分析技术的单独或联合使用，使抽象的活性物质可以通过指纹图谱技术可视化，再结合相似度评价、主成分分析、聚类分析和神经网络等模式识别方法解析、识别饲料或提取物图谱信息，建立指纹图谱量化标准，使可视化的图谱能够通过计算，从而转换为数据进行描述，进而对不同饲料原料及不同来源、不同品种、不同批次的饲料中的营养活性物质进行定性和定量分析。

近年来，实验室利用色谱、光谱等波谱技术以及结合质谱、NMR等联用技术，先后完成了金银花、甘草等4类共22种活性成分指纹图谱的构建及主要活性物质的定性定量分析[16-19]以及相应的动物验证试验，研究结果为深入研究饲料营养活性物质结构-谱-量-效关系提供了理论基础。

2 饲料营养活性物质结构-谱-量-效关系研究现状

2.1 饲料营养活性物质的谱-构关系

动物饲粮是由各种饲料原料按照一定的配比进行混合、加工所得的混合物，因此具有组成复杂、干扰因素众多的特点[20]。谱-构关系构建是实现营养活性物质定性定量分析的基础。将营养活性物质通过HPLC、GC等色谱检测，得出在一定波长下包含所有化合物的色谱图。色谱指纹图谱中的每1个峰都代表了1种物质，对于有标准品的物质可以利用指纹图谱进行化学成分鉴定，没有标准品的化学成分则可以用指纹图谱来表征[21]。根据NMR中氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)等核磁共振图谱与成分之间对应关系，以及质谱中显示的不同的m/z的离子，得到所测化合物的精确质量数和经验分子式，再结合化合物在质谱中的碎片机理和规律以及相关文献即可鉴定出活性成分的化学结构[21-22]。通过对图谱和结构的分析建立饲料营养活性物质的谱-构关系。

Guo等[23]利用高效液相色谱-二极管阵列检测器-飞行时间串联质谱(HPLC-DAD-QTOF-MS/MS)技术，通过将保留时间、紫外、准分子离子、断裂途径与参考标准及相关文献进行比较，鉴定出了厚朴中的31种次木脂素、生物碱和苯丙素苷类化合物的结构。赵莹等[24]通过对小麦粉和小麦麸皮的风味物质进行图谱分析，发现生长在作物不同部位的风味物质的成分结构不同。同样，Chen等[25]利用ESI/MS、13C-NMR和1H-NMR分析得出了无梗五加中的主要花青素结构为Cya-3-Xyl-Gal。谱-构关系研究技术体系的建立为饲料营养活性物质的深入研究提供了方法基础。

2.2 饲料营养活性物质的谱-量关系

饲料原料受品种、产地、采集时间、提取工艺等影响，不同品种、不同来源、不同批次、不同提取方法得到的饲料中的营养活性物质的含量与品质存在较大差异[10]。张巧娥等[26]研究结果所示，不同提取方法可获得同样种类的代谢物，但相对含量存在显著差异，同一类活性物质在不同提取工艺下，结构、组分也存在显著差异。因此，饲料营养活性物质的谱-量关系研究包括2个方面的内容，即指纹图谱对营养活性物质的含量测定、品质鉴定以及指纹图谱结合指标成分定量的研究。色谱-光谱-质谱等联用技术可实现饲料中成分含量之间的谱-量关系研究。

通过参照对照图谱并根据保留时间确定所测成分峰的位置，之后采用内标法、外标法，HPLC的外标一点法、外标两点法、标准曲线法等含量测定方法建立相关模型，根据所测峰的峰面积计算出所测成分的含量。Chen等[25]通过HPLC-DAD得出每100 g无梗五加果实中总花青素含量为121.35 mg。Fu等[27]利用HPLC-DAD定量和LC-ESI-QTOF-MS/MS定性鉴定了不同地区青蒿中5种黄酮类化合物、2种香豆素类化合物和4种倍半萜类化合物的含量。没有标准品的化合物，通过指纹图谱技术结合化学计量学方法(相似度、聚类分析、主成分分析)对建立的指纹图谱的特征峰峰面积进行统计分析和不同批次、不同产地、不同提取工艺中共有峰含量进行相似度评价，从而实现对饲料的品质鉴定[12]。Fu等[27]利用HPLC-DAD定量和LC-ESI-QTOF-MS/MS结合主成分分析和层次聚类分析发现不同地区或者同一地区不同批次的青蒿中这11种成分的含量具有明显的区域特征。

2.3 饲料营养活性物质的谱-效关系

饲料中的营养活性物质具有抗氧化、抗炎和免疫调节、肿瘤抑制以及生长调控功能[28]，这些活性物质在动物体或者人体内发挥作用与其结构与含量密不可分，指纹图谱技术通过对化合物进行结构和含量鉴定，有助于进一步研究营养活性物质的生物学作用。

2.3.1 饲料营养活性物质的谱-构-效关系

饲料营养活性物质的谱-效关系研究是基于化学成分研究和作用效果的结合。饲料营养活性物质的化学结构是其发挥生物学作用的物质基础。吡喃(pyran)是一个不饱和的含氧六元杂环化合物，根据2个不饱和双键位置不同，可以分为2-H吡喃和4-H吡喃，其中4-H吡喃被研究发现具有抗菌、抗过敏、抗肿瘤等诸多药理活性[29]。因此很多含有吡喃环结构单元的天然产物如色烯(苯并吡喃)、黄酮与异黄酮、花青素等也具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗凝血等生物功能[29]。大豆异黄酮结构与雌二醇相似，都具有二羟苯酚，因而具有类雌激素作用[30-31]。Zhang等[32]采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术，结合1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)方法，得到的光谱结果显示枸杞中主要抗氧化成分为绿原酸、槲皮素、山奈酚和异鼠李素。为研究饲料添加剂藤茶不同极性部位HPLC指纹图谱共有峰与其抗炎药效之间的谱-效关系，刘雯等[33]运用灰色关联度法研究发现藤茶对二甲苯致小鼠耳肿胀的抗炎作用是多组分协同作用的结果，其中HPLC指纹图谱中的3号峰的未知成分和二氢杨梅素是藤茶抗炎作用的主要活性成分。俎龙辉等[34]通过自制黄芩提取物，建立HPLC指纹图谱检测方法，初步确定黄芩提取物抑菌药效物质基础主要为汉黄芩苷、汉黄芩素以及白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷。因此，通过指纹图谱技术对饲料中营养活性物质的成分结构进行鉴定，在一定程度上解释了物质的作用机理。

2.3.2 饲料营养活性物质的谱-量-效关系

即使具有相同营养活性物质成分的同一种饲料原料或者同一配方，也会因其来源不同、批次不同或提取工艺不同而表现出一定的作用效果差异[26]。饲料营养活性物质的含量与功效需要依据活性物质发挥生物学作用效果来评价[21]。在营养活性物质作用于动物机体之后，一些生物指纹图谱，如代谢指纹图谱等可以用来表征饲料中营养活性物质的生物效应[21]。通过多组学联合分析结合模式识别方法，可以判断出不同水平的营养活性成分对生物体的生理状态及健康水平的影响，并有可能找出与之相关的生物标志物，进而解析这些成分在动物体内的作用途径和作用机制[35]。Ibrahim等[36]利用高效薄层色谱(HPTLC)得到苜蓿发芽之后的色谱指纹图谱，使用主成分分析进行无监督模式识别方法得出木犀草素-7-O-葡萄糖苷、阿魏酸和对香豆酸是代谢上重要的标志物，通过对这3个关键标志物进行定量分析发现，苜蓿种子和不同日龄苜蓿芽提取物在植物化学、营养和功效特性上发生了显著的变化。HMDB[37]、KEGG[38]、Metlin[39]、GMD[40]和SMPDB[41]等代谢物数据库整合了代谢产物的简介、化学式、分子质量、化学分类、化学性质、所在的代谢通路和质谱图等[42]。用户可以将待鉴定物质的信息与库中代谢物的信息进行一一比对，从而了解到所需代谢物的生物学作用、生理浓度、疾病关联、化学反应、代谢途径和参考光谱的全面信息[37]。指纹图谱作为一种分析工具，在代谢组学的研究及营养活性物质数据库的构建当中发挥了重要作用。

在研究饲料中的营养活性物质组的生理功能时，要注意区分发挥作用效果的主效因子和有效因子，既要强调所有主效因子的整体功能，又要区分饲料营养活性物质主效因子的主次顺序[1]。而营养活性物质谱-量-效关系的确定，一方面将有助于找到添加剂当中发挥作用效果的主效成分，Tang等[43]通过高效凝胶渗透色谱(HPGPC)发现枸杞多糖中发挥抗血糖作用的主要是水溶性多糖3b(LBP3b)，结合体外细胞试验，结果显示LBP3b在不同浓度下均能显著抑制葡萄糖的吸收，且LBP3b浓度越高，葡萄糖摄取越少，抑制葡萄糖摄取的效果越好。Hussain等[44]通过研究双低菜籽粕中酚提取物的抗氧化活性发现HPLC色谱峰中峰2(阿魏酰胆碱桂酰基)是丙酮提取物中相对含量第6大的成分，但是却是在线ABTS自由基清除迹线中的第2个最高峰，反映了较强的自由基清除活性，是双低菜籽粕中酚提取物发挥抗氧化作用的主效因子，说明物质的活性与其相对浓度不成比例。通过体内外相关试验与指纹图谱结合，可以揭示营养活性物质发挥生物学作用的主效因子，从而可以开展整体功能检验与评价。另一方面，可以确定饲料营养活性物质最佳作用效果的最适含量，从而保证其作用效果，避免出现在相同的添加剂量上，不同来源的同种原料表现出不同的促进健康的作用的情况。Lopes等[45]通过高效液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾电离/质谱(HPLC-DAD-ESI/MSn)对薰衣草的酚类成分进行表征，并通过体外分析其抗氧化潜力(DPPH自由基清除活性，降低脂质过氧化能力并抑制脂质过氧化)，对其生物活性进行了评价，结果发现，来自不同地区的薰衣草的生物活性存在差异，与后山(Trás-os-Montes)地区样品相比，来自阿连特茹的样品在所有生物活性方面均显示出更高的结果。综上所述，饲料营养活性物质谱-量-效关系对确定饲料成分及饲料品质、优化饲料配方具有很大的参考价值。

3 结构-谱-量-效综合评价为导向的饲料质量评定方法探索

目前关于饲料营养活性物质的研究与应用还处于探索阶段，今后需要从以下几个方面深入开展相关的研究：1)常用饲料营养活性物质有效因子和主效因子测定、特征指纹图谱数据库建立及定量构效关系模型构建。探究饲料营养活性物质对机体生理功能和代谢的影响，找到发挥主要作用的主效因子以及发挥作用的主次顺序，建立常用饲料以及饲用天然植物饲料原料的特征指纹图谱和主效因子数据库，以数据库构建为基础，采用计算机靶标预测技术，构建营养活性物质与机体免疫互作网络模型，实现对饲料营养活性物质的科学应用[1]；2)饲料或饲粮营养活性物质功效关系评价技术及其作用机理的研究。通过细胞培养和离体试验等体外培养方法，建立主效功能因子体外快速评价技术体系；利用动物试验结合营养生理方法，揭示与评价饲粮营养活性物质主效因子的整体功效[1]。通过细胞试验和动物试验，结合谱效关系，揭示主效因子对动物生产性能及免疫相关基因表达调控的分子机制；3)饲粮营养活性物质营养标准和评价指标的研究；将不同产地、不同来源、不同批次的同种饲料原料进行特征指纹图谱构建与比对，结合相似度评价系统对其营养活性物质的进行定量分析和量效关系评价；4)营养活性物质产品研发和应用技术[1]。研究优化饲料中主要营养活性物质的提取方法，制定相应的提取标准或规范，结合谱-量-效关系，为营养活性物质产品研发和应用提供技术支撑。

4 小 结

通过指纹图谱等现代分析技术，结合饲养或代谢试验，揭示饲料中营养活性物质成分、生物学作用、作用机制以及物质结构、含量和作用效果关系，构建结构-谱-量-效综合评价为导向的饲料质量评价方法，实现成分、结构、含量、品质和生物学作用的直观反映，是饲料营养活性物质在实际生产中广泛应用的技术基础。随着营养活性物质研究的不断深入，将营养活性物质的种类、结构、量效关系进行分类整理，构建饲料中营养活性物质的特征指纹图谱数据库，实现饲料营养活性物质成分及量效作用的快速定性定量分析和畜禽饲粮的精准配合，将有效提高动物的健康状况，实现畜牧业的绿色健康发展。