饲粮添加香菇多糖对轮状病毒攻毒断奶仔猪回肠屏障功能的影响

毛湘冰 胡海燕 陈代文 余 冰 何 军 郑 萍 虞 洁 罗钧秋 罗玉衡 阎 辉

(四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养教育部重点实验室，农业农村部动物抗病营养与饲料重点实验室，动物抗病营养四川省重点实验室，成都 611130)

香菇(shiitake mushroom)是食用最广泛的蘑菇之一，其口感好且营养价值高，多产于亚洲(如中国、日本)。香菇多糖(lentinan,LNT)是从香菇子实体中浸提得到的一种含支链分子的多糖，它的主要成分是β-(1→3)-D-葡聚糖，是具有生物活性的大分子物质。近些年，相关的临床和亚临床研究表明，LNT能调节免疫功能和抗氧化能力，进而发挥抗肿瘤和抗病毒的作用[1-5]。本团队前期的研究表明，饲粮添加LNT能改善断奶大鼠生长性能、抗氧化能力、盲肠微生物组成和空肠黏膜结构[6]，并能改善断奶仔猪的生长性能和免疫力[7]。

作为一种双链RNA病毒，轮状病毒(rotavirus,RV)是导致幼龄动物和婴幼儿严重胃肠炎和腹泻的主要病原之一；流行病学分析发现，仔猪对RV极为易感，初生仔猪感染其的死亡率可达100%，尽管断奶后死亡率会下降，但仍显著影响仔猪生长性能；此外，RV易感部位为消化道前段(如十二指肠、空肠)[8-10]；也有研究报道，RV也会侵袭回肠，并损伤回肠健康[11]。本团队前期的研究已表明，饲粮添加LNT可以改善RV攻毒对仔猪空肠屏障功能的负面影响[12]。但目前对于饲粮添加LNT是否也能够缓解RV攻毒对仔猪回肠健康产生的负面影响尚未见报道。因此，本试验旨在探索饲粮中添加LNT是否能缓解RV攻毒仔猪回肠屏障功能的负面影响，以期进一步完善LNT预防RV感染的可能机制，为LNT在动物生产上的应用和推广提供理论和试验支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

LNT购于四川某生物科技有限公司，其有效成分(多糖)含量>30%；RV为OSU(G5P9)毒株(ATCC#VR-893)，购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 试验动物与设计

试验选取28头体重为(7.51±1.37)kg、健康的21日龄断奶的杂交(“杜×长×大”)阉公猪，采用2×2因子试验设计，即饲粮处理(饲粮添加0或84 mg/kg LNT)和RV攻毒(灌服RV或无菌培养液)。全部仔猪采用代谢笼(1.5 m×0.7 m×1.0 m)饲养。试验第1天，将所有仔猪进行空腹称重，按遗传背景和体重相近原则，将仔猪随机分为2个处理(n=14)，分别饲喂添加不同剂量LNT的饲粮。试验第15天，所有仔猪在灌服5 mL的100 mmol/L碳酸氢钠(NaHCO3)溶液20 min后，从以上2个饲粮处理中随机选取7头仔猪进行RV攻毒，即经口一次性灌服RV液(106TCID50/mL)4 mL，剩余仔猪经口一次性灌服无菌培养液4 mL。试验期为19 d。

1.3 试验饲粮及营养水平

试验使用的基础饲粮为玉米-豆粕型，依据NRC(2012)7～11 kg仔猪营养需要进行设计和配制，其组成及营养水平见表1。而试验饲粮是在基础饲粮中添加0或84 mg/kg LNT进行配制，且LNT是以等量替代基础饲粮中的玉米淀粉进行加入。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.4 饲养管理

所有的动物试验于四川农业大学动物营养研究所教学科研基地代谢室进行。试验的预试期为2 d，使所有仔猪适应粉状饲粮和饲养环境。试验期内，猪舍的温度为27～30 ℃，相对湿度低于80%；每日饲喂仔猪4次(08:00、12:00、16:00和20:00)，以每次采食后料槽略有余料为度，自由饮水。试验期间消毒、清扫按常规程序进行，保持猪舍通风、清洁。

1.5 RV培养

本试验采用恒河猴肾细胞系(MA104)进行RV培养、强化和病毒滴度测定，具体方法按Mao等[13]进行。

1.6 测定指标及方法

1.6.1 腹泻指数

RV攻毒后，对每头仔猪进行粪便评分(0，正常；1，黏性粪便；2，半液体状粪便；3，液体状粪便)，每天2次。用于计算仔猪的腹泻指数，具体方法参考Mao等[13]。

腹泻指数=(∑粪便评分)/n。

式中:n为重复数。

1.6.2 样品采集

试验第20天，对所有仔猪进行空腹采血10 mL，室温静置30 min，3 000 r/min离心15 min，分离血清，保存于-20 ℃。采血后，以心脏注射戊巴比妥钠(50 mg/kg BW)和颈静脉放血的方法屠宰所有仔猪，迅速分离回肠，冰生理盐水冲洗，用载玻片刮取回肠黏膜，液氮速冻，保存于-80 ℃；同时，收集回肠食糜，液氮速冻，保存于-80 ℃。

1.6.3 回肠黏膜中RV特异性抗体(rotavirus antibody,RV-Ab)、分泌型免疫球蛋白A(secreting immunoglobulin A,sIgA)和细胞因子含量的检测

称取约1 g回肠黏膜组织，按1∶9(质量体积比)加入预冷的生理盐水，在冰上匀浆，匀浆液于4 ℃条件下5 000×g离心10 min，取上清液用于RV-Ab(免疫球蛋白M)、sIgA、白细胞介素-2(interleukin 2,IL-2)、白细胞介素-4(interleukin 4,IL-4)和干扰素-γ(interferon γ,IFN-γ)含量的测定，具体测定采用上海诺渊有限公司生产的酶联免疫吸附试剂盒完成，操作按照试剂盒说明书进行；上清液中蛋白含量的测定采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，具体的测定方法参照试剂盒说明书。

1.6.4 血清和回肠黏膜抗氧化能力的测定

称取约1 g回肠黏膜组织，按1∶9(质量体积比)加入预冷的生理盐水，在冰上匀浆，匀浆液于4 ℃条件下5 000×g离心10 min，取上清液用于检测。

血清和回肠黏膜组织上清液样品中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)的测定采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，具体的测定方法参照试剂盒说明书。

1.6.5 回肠黏膜中细胞凋亡、黏液蛋白、紧密连接蛋白和抗菌肽基因mRNA相对表达量的测定

回肠黏膜中B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(B-cell lymphoma/leukaemia 2-associated X protein,Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukaemia 2,Bcl-2)、闭合蛋白(occludin)、闭锁小带蛋白-1(zonula occludens 1,ZO-1)、黏液蛋白1(mucin 1)、黏液蛋白2(mucin 2)、猪β防御素1(porcine β-defensin 1,pBD1)、猪β防御素2(porcine β-defensin 2,pBD2)、猪β防御素3(porcine β-defensin 3,pBD3)和Protegrins 1-5(PG1-5)的mRNA相对表达量，采用实时荧光定量PCR技术测定，具体方法参考Mao等[13]。

1.6.6 回肠食糜中菌群数量的测定

回肠食糜中菌群(总菌、乳酸杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌)的数量采用实时荧光定量PCR技术测定，具体方法参考Mao等[12]。

1.7 数据处理与分析

试验测得的所有数据采用Excel 2016进行初步整理。除了腹泻指数的数据外，其他数据采用SAS 8.1软件中双因素方差分析，模型主效应包括RV攻毒和饲粮添加LNT以及二者之间的互作效应，差异显著时进行Duncan氏法多重比较，各指标以每个重复为单位统计，数据以“平均值±标准误”表示。以P<0.05为差异显著判定标准，以0.05≤P<0.10为有差异趋势的判定标准。

2 结 果

2.1 饲粮添加LNT对RV攻毒断奶仔猪腹泻指数和回肠黏膜中RV-Ab含量的影响

由图1可知，未攻毒仔猪腹泻指数均为0，RV攻毒提高了断奶仔猪的腹泻指数，饲粮添加LNT降低了RV攻毒诱导的腹泻指数。由表2可知，RV攻毒显著提高了断奶仔猪回肠黏膜中RV-Ab的含量(P<0.05)。

图1 饲粮添加LNT对RV攻毒断奶仔猪腹泻情况的影响

2.2 饲粮添加LNT对RV攻毒断奶仔猪回肠黏膜中sIgA和细胞因子含量的影响

由表2可知，RV攻毒显著降低了断奶仔猪回肠黏膜中sIgA、IL-4和IFN-γ的含量(P<0.05)，显著提高了回肠黏膜中IL-2的含量(P<0.05)；饲粮添加LNT显著提高了断奶仔猪回肠黏膜中sIgA和IFN-γ的含量(P<0.05)，显著降低了回肠黏膜中IL-2的含量(P<0.05)；且在RV攻毒仔猪中，饲粮添加LNT显著缓解了RV攻毒对回肠黏膜中sIgA、IFN-γ和IL-2含量的影响(P<0.05)。

表2 饲粮添加LNT对RV攻毒断奶仔猪回肠黏膜中sIgA、RV-Ab和细胞因子含量的影响

2.3 饲粮添加LNT对RV攻毒断奶仔猪血清和回肠黏膜抗氧化能力的影响

由表3可知，RV攻毒显著降低了断奶仔猪血清和回肠黏膜的T-AOC(P<0.05)，显著提高了血清和回肠黏膜中MDA的含量(P<0.05)；饲粮添加LNT显著提高了断奶仔猪血清和回肠黏膜的T-AOC(P<0.05)，显著降低了回肠黏膜中MDA的含量(P<0.05)，有降低血清中MDA含量的趋势(P=0.06)；且在RV攻毒仔猪中，饲粮添加LNT显著缓解了RV攻毒对血清和回肠黏膜T-AOC及回肠黏膜中MDA含量的影响(P<0.05)。

表3 饲粮添加LNT对RV攻毒断奶仔猪血清和回肠黏膜抗氧化能力的影响

2.4 饲粮添加LNT对RV攻毒断奶仔猪回肠黏膜中细胞凋亡、黏液蛋白、紧密连接蛋白和抗菌肽基因mRNA相对表达量的影响

由表4可知，RV攻毒显著提高了断奶仔猪回肠黏膜中Bax的mRNA相对表达量(P<0.05)，显著降低了回肠黏膜中Bcl-2、occludin、ZO-1、mucin 1、mucin 2、pBD1、pBD2、pBD3和PG1-5的mRNA相对表达量(P<0.05)；饲粮添加LNT显著提高了断奶仔猪回肠黏膜中Bcl-2、occludin、ZO-1、mucin 1、mucin 2、pBD1、pBD2、pBD3和PG1-5的mRNA相对表达量(P<0.05)；且在RV攻毒仔猪中，饲粮添加LNT显著缓解了RV攻毒对回肠黏膜中occludin、ZO-1、mucin 1、mucin 2、pBD2、pBD3和PG1-5的mRNA相对表达量的影响(P<0.05)。

表4 饲粮添加LNT对RV攻毒断奶仔猪回肠黏膜中细胞凋亡、紧密连接蛋白、黏液蛋白和抗菌肽基因表达的影响

2.5 饲粮添加LNT对RV攻毒断奶仔猪回肠食糜中菌群数量的影响

由表5可知，RV攻毒显著降低了断奶仔猪回肠食糜中双歧杆菌、乳酸菌和总菌的数量(P<0.05)；但饲粮添加LNT对断奶仔猪回肠食糜中菌群数量无显著影响(P>0.05)。

表5 饲粮添加LNT对RV攻毒断奶仔猪回肠食糜中菌群数量的影响

3 讨 论

在诱导幼龄动物和婴幼儿胃肠炎和腹泻的病原中，RV是主要的病毒性病原之一[8-10]。在目前的仔猪试验中，RV攻毒提高了断奶仔猪的腹泻指数，影响了回肠的炎性细胞因子水平和食糜中有益菌群数量，损伤了回肠的抗氧化能力和黏膜屏障功能，这与本课题组前期的研究结果[14-16]一致。除此之外，本试验结果表明，RV攻毒显著提高了断奶仔猪回肠黏膜中RV-Ab的含量；且对于生长性能的观察发现，RV攻毒还显著降低了断奶仔猪的生长性能[17]。由此可知，本研究成功构建了断奶仔猪RV感染模型；而饲粮添加LNT可降低断奶仔猪腹泻指数，并在一定程度缩短腹泻病程，以及改善了RV攻毒断奶仔猪的生长性能[17]，这说明其可改善仔猪机体(尤其是肠道黏膜)的健康。

肠道的免疫功能是机体抵御病原入侵的重要屏障之一。免疫球蛋白(尤其是sIgA)在保护肠道黏膜免受病原侵袭和抑制病毒增殖等方面发挥着十分重要的作用[18]。除此之外，细胞因子也是肠道免疫功能的重要组成成分。Th1/Th2细胞因子的平衡可以有效地维持免疫功能[19]；且IFN-γ是一种广谱的抗病毒成分，能通过诱导细胞产生抗病毒蛋白抑制病毒增殖[20]。内源性抗菌肽的产生是先天性免疫的组成成分，而防御素是一类由白细胞和上皮细胞产生的内源性抗菌肽，其在抗病毒入侵中也发挥了重要的作用[21]。本试验的结果表明，在RV攻毒仔猪中，饲粮添加LNT提高了断奶仔猪回肠黏膜中sIgA和IFN-γ含量，上调了回肠黏膜中pBD2、pBD3和PG1-5的mRNA表达，缓解了RV攻毒对回肠黏膜中IL-2和IL-4含量的影响。这些表明，饲粮添加LNT改善了仔猪回肠黏膜免疫功能，进而缓解了RV感染。

物理屏障和化学屏障也是肠道屏障功能的重要组成成分，物理屏障主要体现在肠道黏膜上皮细胞间的紧密连接，而肠道黏膜胶质层是化学屏障的主要来源[22]。一般来说，肠道上皮细胞间紧密连接的状态可由相关紧密连接蛋白表达量说明[23]；肠道黏膜胶质层的主要成分是由黏膜上皮细胞(尤其是杯状细胞)产生的黏液蛋白[24]。本试验的结果表明，饲粮添加LNT可缓解RV攻毒对仔猪回肠黏膜中上皮紧密连接蛋白(ZO-1和occludin)和黏液蛋白(mucin 1和mucin 2)基因表达的影响，那么，LNT防止RV侵袭回肠可能与其增强肠道黏膜物理屏障和化学屏障有关。

机体的氧化还原平衡与细胞(乃至生物体本身)的健康息息相关，细胞、组织和器官内的氧化应激将诱导凋亡的发生，进而破坏组织和器官的相关功能[25]。起始于细胞线粒体内的凋亡受到Bcl-2家族蛋白的调节，其中，就包含抗凋亡蛋白(如Bcl-2)和促凋亡蛋白(如Bax)[26-27]。而本实验室前期的试验表明，RV感染引起的肠道屏障功能(尤其是物理屏障和化学屏障)损伤主要源于其通过破坏肠道上皮细胞的氧化还原状态导致了细胞凋亡的增加[28]。本试验的结果表明，在RV感染仔猪中，饲粮添加LNT提高了仔猪血清T-AOC，从而提高了仔猪回肠黏膜的抗氧化能力，改善了RV诱导的氧化还原状态失衡；并提高了仔猪回肠黏膜中Bcl-2的mRNA相对表达量。因此，LNT改善RV攻毒仔猪回肠屏障功能(尤其是物理屏障和化学屏障)与其缓解氧化还原状态失衡诱导的细胞凋亡有关。

本实验室前期以大鼠和断奶仔猪为对象的研究表明，饲粮添加LNT可调节盲肠内容物菌群组成(即提高有益菌的数量，降低有害菌的数量)[6,12]。但本试验的结果表明，饲粮添加LNT对回肠食糜中总菌、大肠杆菌、乳酸菌和双歧杆菌的数量均未产生显著影响。这可能说明，LNT对这些测定的肠道菌群调节作用主要集中于后肠段(即大肠)，而LNT对整个肠段中微生物菌群的影响还有待于通过高通量测序的方式进行深入研究。

基于本试验中LNT可改善回肠屏障功能，缓解RV侵入回肠，与本实验室前期进行的LNT处理调节RV感染仔猪空肠屏障功能的研究结果[7,12]对比，可以发现LNT在回肠中的改善效果并未达到其在空肠中的效果。分析其原因，可能在于RV感染对回肠屏障功能的负面影响弱于其对空肠的影响(即RV侵袭部位主要在肠道的前段)。

4 结 论

饲粮添加LNT可以缓解RV感染诱导的断奶仔猪腹泻，这一作用可能源于其改善了回肠黏膜上皮细胞抗氧化能力，减弱了RV诱导的细胞凋亡，进而强化了回肠屏障功能(包括免疫功能、物理屏障和化学屏障)。