巴马香猪回肠、结肠消化特征研究

莫家远 路玉洁 綦文晶 朱思燃 奉玲丽 高九昱 梁 靓 王 晖 兰干球 梁 晶

(广西大学动物科学技术学院，南宁 530004)

巴马香猪由于在解剖学和生理学上与人类有很多共同之处，还具备体型小、容易控制等优势，可以被培育为试验动物用于人类研究[1-5]。食糜在动物不同肠段内吸收的物质并不一致，同时不同肠段内还存在着不同的微生物群落，其丰度也有很大的差异[6-7]，这就导致了不同肠段内容物的构成具有很大的差异。因此，猪特别是与人生理状态更相似的广西巴马香猪的肠道内容物的变化引起了畜牧研究者还有医学研究者的关注，理解广西巴马香猪的消化特征不仅利于理解猪的消化特点，而且更有利于理解人的消化特点。目前对动物体内肠道内容物的研究通常是使用16S RNA测序或者宏基因组测序等方法，研究其微生物菌群差异和功能[8-10]，但是对于肠道内容物本身组成成分的研究还比较缺乏。随着生物技术的发展，各种组学手段层出不穷，代谢组学是继转录组学和蛋白质组学之后的新兴组学技术，用于对生物样品(如血液、尿液、粪便等)中所有小分子代谢物(<1 ku)进行定性和定量分析，代表着机体已经发生过的改变，对研究动物机体的动态变化具有重要意义[11]。Sinha等[12]同时使用宏基因组、微生物组、转录组和代谢组学技术研究小鼠结肠炎模型发现补充次级胆汁酸会减轻肠道炎症，这也提示我们在研究动物肠道内容物的过程之中不应该只研究肠道内的菌群组成，其内容物的物质组成的研究同样具有很重要的意义。因此，本研究通过采集巴马香猪成年母猪回肠和结肠中段内容物，利用代谢组学方法、无监督主成分(PCA)分析和监督正交偏最小二乘判别(OPLS-DA)分析等方法，探讨巴马香猪回肠和结肠内容物的组成差异，以期筛选、鉴定其差异代谢物及其代谢途径，了解巴马香猪回肠和结肠的消化特征，为更深入理解机体的营养吸收过程和肠道微生物的作用机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验样品采集

随机屠宰来自于广西壮族自治区巴瑶族自治县巴马原种香猪农牧实业有限公司9头10月龄巴马香猪母猪，体重为(33.72±2.05)kg，采集其回肠中段和结肠中段内容物，分为回肠组和结肠组，立即放入液氮中冷冻后转移到-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要试剂和仪器

色谱级甲醇购自美国默克公司；色谱纯甲酸购自美国西格玛奥德里奇公司；UPLC-Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪和Ultimate 3 000超高效液相色谱系统购自美国赛默飞世尔科技公司；高速冷冻离心机购自Eppendorf公司。

1.3 试验样品处理

将回肠和结肠内容物放入1.5 mL离心管中，加入3倍体积的甲醇，涡旋混合溶解30 s后4 ℃、13 000 r/min离心10 min并通过0.22 μm的膜过滤。

1.4 超高压液相色谱-串联质谱分析条件

色谱条件：色谱柱为Hypersil GOLD C18(50 mm×2.1 mm,1.9 μm)，流动相为0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)，洗脱梯度，洗脱液配比见表1。流速为0.3 mL/min，进样体积2 μL，进样室温度为4 ℃，柱温为30 ℃。

表1 UPLC-MS/MS分析洗脱梯度变化

质谱条件：离子源为ESI源，正、负离子检测模式，鞘气(N2)压力40 psi；辅助气体(N2)压力10 psi；喷雾电压3.5 kV；离子传输管温度320 ℃；辅助气温度350 ℃；质谱扫描范围为100～1 000 m/z，扫描模式为Full MS/dd-MS2。

1.5 数据分析

利用Compound Discover 3.1软件采用精确质量匹配(<25 mg/L)和二级光谱匹配对原始数据进行处理，对代谢物进行峰对齐，校正代谢物的保留时间，提取代谢物的峰面积。将所有代谢物的峰面积输入SIMCA-P软件(14.1版本，Umetrics)进行多变量分析，包括PCA、OPLS-DA。基于模型对Y变量的解释率(R2Y)对OPLS-DA模型进行了验证，并通过200次迭代对交叉验证和排列检验中基于模型预测能力(Q2)进行了验证。使用SPSS 19.0对不同肠段的代谢物进行独立样本t检验和倍数变化分析。采用OPLS-DA模型的变量重要性投影(VIP)评分(VIP>2)、t检验的P值(P<0.01)和组间差异倍数(FC,FC>2或FC<0.5)三重标准筛选差异显著的代谢物。使用代谢途径分析网络工具MetaboAnalyst 5.0(http://metpa.metabolomics.ca)以及HMDB网站(https://hmdb.ca/metabolites/)KEGG网站(http://www.genome.jp/kegg/)分析差异物性质和代谢路径。

2 结果与分析

为了研究巴马香猪回肠和结肠内容物的组成差异，本研究通过UPLC-MS/MS方法进行了非靶向代谢谱分析，正、负离子模式分别获得了26 119和16 265个质谱峰。使用Compound Discover 3.1软件去除RSD大于30%的质谱峰，经过代谢物结构鉴定、准确的质量匹配和二级光谱搜索mzCloud和HMBD数据库，正、负离子模式分别匹配了6 403和1 912种不同的代谢物。

2.1 不同肠段内容物PCA分析

使用SMICA-P软件比较正、负离子模式下各代谢物的峰面积，并进行主成分分析结果显示，在正、负离子模式下模型对X的解释率(R2X)分别为0.630和0.665。9个质量控制(QC)样均集中分布在中心点，各样品分布位于中心点左右，说明本研究使用的仪器稳定性可靠，具有很好的重复性(图1)。

图A:正离子模式；图B:负离子模式；H:回肠；J:结肠；QC:质量控制样品。图2、图3同。

2.2 不同肠段内容物OPLS-DA分析

使用OPLS-DA模式分析2组间代谢物的差异，结果显示，2组代谢物的分离度好，在正离子模式下R2Y为0.989，Q2为0.947；在负离子模式下R2Y为0.971，Q2为0.939(图2)，表明OPLS-DA模式下的模型稳定、可靠，得到的差异代谢物可以反映不同肠段内容物之间的差异。

图2 OPLS-DA得分图

2.3 不同肠道内容物迭代验证

对交叉验证和排列检验中基于模型的预测能力进行200次迭代验证，结果显示，正、负离子模式下的预测能力回归直线截距分别为-0.705和-0.892(图3),说明本研究的模型拟合良好，没有出现过度拟合的现象。

R2Y:模型对Y变量的解释率；Q2:模型预测能力。

2.4 极显著差异代谢物筛选

采用VIP>2(图4)、P<0.01和FC>2或FC<0.5三重标准筛选极显著差异代谢物，结果显示，共有42种极显著差异代谢物被筛选出来(表2)，正离子模式35种，负离子模式8种，其中十二烷二酸在2种模式下均被鉴定为极显著差异代谢物。

表2 极显著差异代谢物性质

图A、图B:正离子模式；图C、图D：负离子模式。Figures A and B: the model of positive ion；figures C and D: the model of negative ion.

2.5 代谢途径分析

使用Metaboanalyst 5.0对极显著差异代谢物进行富集分析发现，L-苯丙氨酸、甘鹅去胆酸、苯丙氨酸、缬氨酸、牛磺胆酸、酪氨酸、烟酸盐、sn-甘油-3-磷酸胆碱、肌酸、蛋氨酸、花生酮、4,4-二甲基-5α-胆固醇-8,14,24-三烯-3β-醇、L-酪氨酸和甘胆酸共14种代谢物共参与了19条代谢途径(表3和图5)。

表3 差异代谢物参与的代谢途径

图5 KEGG通路图

3 讨 论

肠道是动物的消化吸收器官分为小肠与大肠2个部分，食糜在动物体内先后经过十二指肠、空肠和回肠被吸收大量营养物质后到达结肠、直肠，进一步被重吸收水分和无机盐等物质，最终成为粪便排出体内。脂肪、蛋白质和碳水化合物等营养物质都需要在肠道内分解成为小分子物质才能被吸收进入体内，提供动物生命活动所需要的能量。食糜在经过不同肠段后其组成成分均会有所差异，主要是因为肠道的消化吸收作用和肠道微生物的分解分泌作用。代谢组学在1999年出现后逐渐被研究者关注[13]，但是主要集中在人类的研究上面[14-16]。由于代谢组学本身是研究物质的组成的一种技术，可以对组成复杂的物质进行定性和定量分析，因此利用代谢组学可以充分地分析动物肠道内不同肠段的内容物组成，从而研究猪肠道内容物组成的差异，能为研究者更深入理解机体的营养吸收过程和肠道微生物的作用机制提供新的见解，以期更进一步理解机体的生命变化过程。

3.1 巴马香猪回肠、结肠代谢组学质控

本研究使用SMICA-P软件进行PCA和OPLS-DA分析，结果显示PCA分析R2X模型解释率超过0.6，且9个QC样均集中分布在中心点；OPLS-DA分析R2Y和Q2均超过为0.93；200次迭代验证的Q2截距均小于0.05，说明本研究的仪器稳定性和分析模式稳定性均良好，没有出现过度拟合现象，分析得到的结果可以代表巴马香猪回肠、结肠内容物的差异。本研究将极显著差异代谢物的标准设置为同时满足VIP>2、P<0.01和FC>2或FC<0.5 3个条件，比一般的代谢组学研究标准更严格[17-19]，因此筛选得到的42种极差异代谢物更能代表回肠内容物和结肠内容物的真实差异，并有可能作为回肠和结肠内容物的生物标志物。

3.2 高胆汁酸吸收效率是回肠的消化特征

本研究筛选到了42种差异代谢物，并进行代谢途径分析发现。42种差异代谢物包含了甘鹅去氧胆酸、甘鹅去氧胆酸(钠盐)、甘胆酸、猪去氧胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸、牛去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺酰脱氧胆酸和牛磺酰脱氧胆酸(钠盐)共10种不同种类的与胆酸相关的代谢物，均在回肠内容物中的含量高于结肠内容物90～20 574倍。同时VIP值超过10的6种代谢物有4种是与胆酸相关的代谢物，分别为甘鹅去氧胆酸、甘鹅去氧胆酸(钠盐)、甘胆酸和猪去氧胆酸，说明胆汁酸在回肠内容物和结肠内容物的含量差异巨大。而甘鹅去氧胆酸、牛磺胆酸和甘胆酸3种胆酸相关的代谢物参与了初级胆汁酸生物合成以及牛磺酸和低牛磺酸代谢2条代谢途径，其中胆汁酸在肠道主要起到分解脂肪等作用，已经在各种脂肪相关的疾病中被广泛报道[20-22]。胆汁酸从肝脏中分泌到胆囊储存后输入肠道内促进脂肪的乳化，到达回肠后段被重吸收到胆囊池中进行储存，只有5%被排出体内[23-25]，与本研究中发现回肠内容物的各类胆汁酸相关的物质均高于结肠内容物的结果一致。同时胆汁酸的合成还是胆固醇分解的主要途径[20,26]，本研究中4,4-二甲基胆甾-8,14,24-三醇作为胆固醇的衍生物在结肠内容物中的含量比回肠内容物高137倍，这也符合回肠、结肠的生理特性。因此可以证明胆汁酸在小肠中消化脂肪类物质之后，在回肠末端被吸收回肝脏储存，只有小部分会进入结肠中，被结肠中的微生物利用或者排除体内，高胆汁酸吸收效率是回肠的消化特征。

3.3 高氨基酸吸收效率是回肠的消化特征

在42种差异代谢物中存在苯丙氨酸、正亮氨酸、DL-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和L-蛋氨酸6种氨基酸，其中苯丙氨酸、DL-色氨酸和L-缬氨酸3种氨基酸为必需氨基酸，6种氨基酸在回肠内容中含量均高于结肠内容物5～21倍。L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、蛋氨酸、缬氨酸和肌酸5种代谢物参与了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路、苯丙氨酸代谢通路、氨酰tRNA生物合成通路、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成通路、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路、半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路、精氨酸和脯氨酸代谢通路、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路以及酪氨酸代谢通路共9条与氨基酸合成与代谢相关的通路。研究表明，部分氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸等能逃过小肠的吸收作用到达结肠等大肠肠段被微生物利用，产生吲哚等物质[27-29]。同样地，肌酸作为精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸合成的氨基酸衍生物[30-31]也与苯丙氨酸等6种氨基酸一样在回肠内容物中的含量高于结肠内容物，这也充分说明了大量的苯丙氨酸、正亮氨酸、DL-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-蛋氨酸和肌酸在回肠被吸收进入机体内，以供机体的生命活动使用，但是还有部分氨基酸进入结肠等肠段，高氨基酸吸收效率是回肠的消化特征。

3.4 高微生物代谢产物是结肠消化特征

十二烷二酸在正、负离子模式中均被鉴定为差异代谢物，且2种模式下在结肠内容物中的含量比回肠内容物分别高404和1 327倍，研究发现十二烷二酸是一种水溶性的脂类和碳水化合物代谢的中间产物[32]，可以通过微生物方法合成[33-34]，这提示结肠内十二烷二酸含量的升高可能是由于脂类和碳水化合物代谢与微生物合成的双重原因导致的。同时，3-甲基二氧吲哚作为结肠内细菌产生的色氨酸代谢产物3-甲基吲哚的体内氧化产物[35]，在本研究中其在结肠内容物中的含量比回肠中高970倍。十二烷二酸和3-甲基二氧吲哚都在结肠内容物中含量比回肠高约1 000倍，且2种物质为回肠、结肠含量差异最大的2种差异代谢物，因此认为高微生物代谢产物是结肠消化特征。

4 结 论

本研究通过非靶向代谢组学技术分析了巴马香猪回肠和结肠的消化特征，PCA分析发现仪器稳定、可靠；OPLS-DA分析发现模型稳定性良好，没有出现过度拟合现象；共有42种极显著差异代谢物被筛选出来，正离子模式35种，负离子模式8种；共14种代谢物参与了19条代谢途径；高胆汁酸和氨基酸吸收效率是回肠的消化特征；高微生物代谢产物是结肠消化特征。