抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对肉仔鸡生长性能、肠道形态以及盲肠微生物区系的影响

朱随亮 李 玥 郑 旭 张静静 王世琼 张 薇 谭 静 王逢久 乔英英 刘长忠 王志祥*

(1.河南农业大学动物科技学院，郑州 450002；2.河南加旺生物科技有限公司，郑州 450002；3.河南科技学院，新乡 453000)

随着抗生素在畜产品中的残留、耐药菌株的产生及过量排泄造成环境的污染等问题[1]日益严峻，国家农业农村部发布194号公告，规定自2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料[2]。在抗生素禁用的情况下，寻找绿色、安全、高效的抗生素替代品已成为研究热点。抗菌肽(AP)是一类具有广谱抗菌活性的多肽类物质，可以增强动物抗病力和免疫功能，提高畜禽生产性能，改善畜禽肠道组织结构，促进肠道动态的菌群平衡[3]。苯甲酸是酸化剂(AC)中的一种，研究发现酸化剂的使用对肉仔鸡的生长和饲料转化率[4]、养分利用[5]、肠道形态计量指数[4]和微生物群活性[6]有积极影响。功能性寡糖(FOS)具有抑制病原菌繁殖、增强畜禽免疫功能、改善肠道健康等功效，能够提高畜禽生产性能[7]。目前，抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖作为单一的添加剂在肉仔鸡饲粮中的应用研究报道较多，但对于抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合使用的研究较少。因此，本试验选用抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加作为抗生素替代品，评价其对肉仔鸡的生长性能、血清免疫指标、肠道形态以及盲肠微生物区系的影响，为抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖在肉仔鸡生产中的联合应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验设计

抗菌肽、酸化剂、功能性寡糖和抗生素均为市售商品，由河南某生物科技有限公司提供。抗菌肽成分为抗菌多肽APSH-07及其他代谢产物(多肽、小肽、乳酸和氨基酸等)，其中APSH-07≥1%；酸化剂有效成分为苯甲酸≥40%，水分≤10%；功能性寡糖为酵母寡糖；抗生素为土霉素钙(以50 mg/kg土霉素有效成分计)。

试验选取1日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡720只，随机分为6组，每组6个重复，每个重复20只(公母各占1/2)，各重复体重接近。对照组(NC组)饲喂基础饲粮，抗生素组(AN组)在基础饲粮中添加500 mg/kg土霉素钙，试验组分别在基础饲粮中添加300 mg/kg抗菌肽+200 mg/kg功能性寡糖(AP+FOS组)、300 mg/kg抗菌肽+350 mg/kg酸化剂(AP+AC组)、350 mg/kg酸化剂+200 mg/kg功能性寡糖(AC+FOS组)及300 mg/kg抗菌肽+350 mg/kg酸化剂+200 mg/kg功能性寡糖(AP+AC+FOS组)。试验期42 d。

1.2 基础饲粮和饲养管理

基础饲粮参照NRC(1994)肉仔鸡营养需要配制，为玉米-豆粕型饲粮，其组成及营养水平见表1。试验开始前对鸡舍进行消毒。采用3层重叠式笼养，自由采食与饮水。采用自然采光和白炽灯补光相结合，24 h光照。注意保温，记录每天的喂料量、温度和湿度。按正常免疫程序进行免疫接种。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长性能

分别于试验的第1、21和42天空腹称量各重复试验鸡的体重，并记录其耗料量，计算各阶段平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.3.2 血清免疫球蛋白含量

试验第42天，每个重复随机挑选1只健康并且接近平均体重的雄性肉仔鸡，颈静脉采血5 mL，3 000 r/min离心10 min(新康X703 80-2医用离心机)，取上清液，分装于1.5 mL EP管中，置于-80 ℃冰箱(Thermo Fisher 88500V63，美国)保存待测。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(购自上海酶联生物科技有限公司)测定血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)的含量。

1.3.3 肠道形态学观察

试验第42天，每个重复随机挑选1只健康并且接近平均体重的雄性肉仔鸡，屠宰后剪取3～5 cm的十二指肠、空肠和回肠肠段，肠段内容物用0.9%生理盐水缓慢冲洗干净，放入4%甲醛溶液中固定24 h以上，进行常规石蜡包埋，切片，用苏木精-伊红(HE)染色法进行染色，在倒置荧光显微镜(OLYMPUS CKX53，日本)下观察，测量肠道的绒毛高度、隐窝深度，并计算肠绒毛高度与隐窝深度的比值(V/C)。

1.3.4 盲肠微生物区系

取上述屠宰肉仔鸡的盲肠内容物于2 mL灭菌EP管中，置于-80 ℃冰箱(Thermo Fisher 88500V63冰箱，美国)保存。由北京百迈客生物科技有限公司基于Illumina HiSeq 2500平台，采用双末端测序(paired-end)方法进行细菌16S rDNA高通量测序分析，使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)进行PCR扩增，再纯化扩增产物，构建文库，上机测序以及结果分析等。

1.4 数据统计分析

试验数据使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，以P<0.05为差异显著的标准。

2 结 果

2.1 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对肉仔鸡生长性能的影响

由表2可知，1～21日龄，与NC组和AN组相比，AP+FOS组、AP+AC组、AC+FOS组和AP+AC+FOS组肉仔鸡21日龄体重、ADG和ADFI无显著差异(P>0.05)；与NC组相比，AP+FOS组F/G显著降低(P<0.05)；与AC+FOS组相比，AP+FOS组和AP+AC+FOS组肉鸡21日龄体重和ADG显著提高(P<0.05)，AP+FOS组F/G显著降低(P<0.05)。22～42日龄，与NC组相比，AN组、AP+FOS组、AP+AC组、AC+FOS组和AP+AC+FOS组肉仔鸡42日龄体重和ADG均显著提高(P<0.05)，且F/G均显著降低(P<0.05)；与AN组相比，AP+FOS组、AP+AC组、AC+FOS组和AP+AC+FOS组肉仔鸡42日龄体重、ADG和F/G均无显著差异(P>0.05)；各组肉仔鸡ADFI无显著差异(P>0.05)，但AP+AC组和AC+FOS组肉仔鸡ADG显著高于AP+AC+FOS组(P<0.05)。1～42日龄，与NC组相比，AN组、AP+FOS组、AP+AC组、AC+FOS组和AP+AC+FOS组肉仔鸡ADG均显著提高(P<0.05)，F/G均显著降低(P<0.05)；与AN组相比，AP+FOS组、AP+AC组和AC+FOS组和AP+AC+FOS组肉仔鸡ADG无显著差异(P>0.05)；各组肉仔鸡ADFI无显著差异(P>0.05)。

表2 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对肉仔鸡生长性能的影响

2.2 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对42日龄肉仔鸡血清免疫指标的影响

由表3可知，与NC组和AN组相比，AP+FOS组、AP+AC组和AP+AC+FOS组肉仔鸡血清IgA含量显著提高(P<0.05)，且AP+FOS组、AP+AC组和AP+AC+FOS组肉仔鸡血清IgA含量显著高于AC+FOS组(P<0.05)。与NC组和AN组相比，AP+FOS组、AP+AC组和AC+FOS组肉仔鸡血清IgG含量显著提高(P<0.05)，且AP+FOS组、AP+AC组和AC+FOS组肉仔鸡血清IgG含量显著高于AP+AC+FOS组(P<0.05)。与NC组相比，AN组、AP+FOS组、AP+AC组、AC+FOS组和AP+AC+FOS组肉仔鸡血清IgM含量显著提高(P<0.05)；与AN组相比，AP+FOS组、AP+AC组、AC+FOS组和AP+AC+FOS组肉仔鸡血清IgM含量差异不显著(P>0.05)。

表3 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对42日龄肉仔鸡血清免疫指标的影响

2.3 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对42日龄肉仔鸡肠道形态的影响

由表4可知，与NC组相比，AP+AC组和AC+FOS组肉仔鸡十二指肠绒毛高度显著提高(P<0.05)；与AN组相比，AP+AC组和AC+FOS组肉仔鸡十二指肠绒毛高度显著提高(P<0.05)。与NC组相比，AN组、AP+FOS组、AP+AC组、AC+FOS组和AP+AC+FOS组肉仔鸡十二指肠隐窝深度显著降低(P<0.05)；与AN组相比，AP+FOS组、AP+AC组、AC+FOS组和AP+AC+FOS组肉仔鸡十二指肠隐窝深度差异不显著(P>0.05)。与NC组相比，AP+FOS组、AP+AC组、AC+FOS组和AP+AC+FOS组肉仔鸡十二指肠V/C显著提高(P<0.05)；与AN组相比，AP+AC组和AC+FOS组肉仔鸡十二指肠V/C显著提高(P<0.05)。

表4 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对42日龄肉仔鸡肠道形态的影响

2.4 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对42日龄肉仔鸡盲肠微生物区系的影响

2.4.1 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对42日龄肉仔鸡盲肠微生物alpha多样性的影响

由表5可知，与NC组相比，AP+FOS组肉仔鸡盲肠微生物ACE指数显著提高(P<0.05)；与AN组相比，AP+FOS组、AP+AC组、AC+FOS组和AP+AC+FOS组肉仔鸡盲肠微生物ACE指数显著提高(P<0.05)。与NC组相比，AP+FOS组肉仔鸡盲肠微生物Chao1指数显著提高(P<0.05)；与AN组相比，AP+FOS组和AP+AC+FOS组肉仔鸡盲肠微生物Chao1指数显著提高(P<0.05)。与NC组相比，AN组、AP+FOS组、AP+AC组和AC+FOS组肉仔鸡盲肠微生物Shannon指数差异不显著(P>0.05)，AP+AC+FOS组显著降低(P<0.05)；与AN组相比，AP+FOS组肉仔鸡盲肠微生物Shannon指数显著提高(P<0.05)，AP+AC+FOS组显著降低(P<0.05)，AP+AC组和AC+FOS组差异不显著(P>0.05)。

表5 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对42日龄肉仔鸡盲肠微生物alpha多样性的影响

2.4.2 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对42日龄肉仔鸡盲肠微生物门水平物种组成的影响

图1展示了42日龄肉仔鸡盲肠微生物门水平的相对丰度排行前10位的微生物。从图中可以看出，各组盲肠菌群主要由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和软壁菌门(Tenericutes)等组成，优势菌门为厚壁菌门和拟杆菌门。从图2可以看出，与NC组相比，AN组厚壁菌门相对丰度显著提高(P<0.05)，AP+FOS组、AC+FOS组和AP+AC+FOS组厚壁菌门相对丰度显著降低(P<0.05)；与AN组相比，AP+FOS组、AP+AC组、AC+FOS组和AP+AC+FOS组厚壁菌门相对丰度显著降低(P<0.05)。与NC组相比，AN组拟杆菌门相对丰度显著降低(P>0.05)，AP+FOS组和AC+FOS组显著提高(P<0.05)；与AN组相比，AP+FOS组、AP+AC组和AC+FOS组拟杆菌门相对丰度显著提高(P<0.05)。此外，除AP+AC+FOS组优势菌门相对丰度占总菌门丰度的68%外，其余各组优势菌门相对丰度均占总菌门丰度的80%以上，且AN组优势菌门相对丰度最高，达到了89%。

Firmicute:厚壁菌门;Bacteroidetes:拟杆菌门;Verrucomicrobia: 疣微菌门;Proteobacteria:变形菌门;Actinobacteria:放线菌门;Tenericutes:软壁菌门;Synergistetes:互养菌门;Cyanobacteria:蓝藻细菌门;Elusimicrobia:迷踪菌门;Deferribacteres:脱铁杆菌门;Others:其他。

数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

bacteria at phylum level

2.4.3 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对42日龄肉仔鸡盲肠微生物属水平物种组成的影响

图3展示了42日龄肉仔鸡盲肠微生物属水平的相对丰度排名前30位的微生物。从图中可以看出，各组的前30位微生物总和占总菌属丰度80%以上。从图4可以看出，与NC组相比，AN组未培养细菌f毛螺菌科(uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae)相对丰度显著提高(P<0.05)，AP+AC+FOS组显著降低(P<0.05)；与AN组相比，AP+FOS组、AP+AC组、AC+FOS组和AP+AC+FOS组未培养细菌f毛螺菌科相对丰度显著降低(P<0.05)。与NC组和AN组相比，AP+AC组瘤胃球菌科UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)相对丰度显著提高(P<0.05)。与NC组相比，AP+FOS组、AP+AC组和AC+FOS组互养菌属(Synergistes)相对丰度显著提高(P<0.05)；与AN组相比，AP+FOS组、AP+AC组、AC+FOS组和AP+AC+FOS组互养菌属相对丰度显著提高(P<0.05)。与NC组和AN组相比，AP+FOS组和AC+FOS组脱硫弧菌属(Desulfovibrio)相对丰度显著提高(P<0.05)。

[Ruminococcus]_torques_group:瘤胃球菌转矩群;Bacteroides:拟杆菌属;Uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae:未培养细菌f毛螺菌科;Akkermansia:艾克曼菌属;Ruminococcaceae_UCG-014:瘤胃球菌科UCG-014;Uncultured_bacterium f_Ruminococcaceae:未培养细菌f瘤胃球菌科;Christensenellaceae_R-7_group:克里斯滕森菌科R-7群;Desulfovibrio:脱硫弧菌属;Olsenella:欧陆森氏菌属;Faecalibacterium:粪杆菌属;Subdoligranulum:小球菌属;Ruminococcaceae_NK4A214_group:瘤胃球菌科NK4A214群;Uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae:未培养细菌f鼠杆菌科;Lactobacillus:乳杆菌属;Alistipes:别样杆菌属;Butyricicoccus:丁酸球菌属;Ruminiclostridium_5:瘤胃梭菌属5;Megamonas:巨单胞菌属;Phascolarctobacterium:考拉杆菌属;Uncultured_bacterium_o_Mollicutes_RF39:未培养细菌o柔膜菌纲RF39;Slackia:斯莱克氏菌属;Ruminiclostridium_9:瘤胃梭菌属9;[Eubacterium]_coprostanoligenes_group:产粪甾醇真细菌群;Synergistes:互养菌属;Others:其他。

图4 属水平差异菌相对丰度

3 讨 论

3.1 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对肉仔鸡生长性能的影响

生长性能是反映肉仔鸡生长最直接的指标，提高生长性能是增加经济效益的关键[8]。研究发现，饲粮单独添加抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖均能够提高家禽的生长性能[9-11]。黄剑韬等[12]报道，在“麒麟鸡”饲粮中组合添加酸化剂与寡糖，在1～14日龄和1～28日龄对提高ADG互作效应显著。余绍海[13]研究发现，甘露寡糖与抗菌肽组合使用对肉用番鸭的日增重增加效果显著高于抗生素、甘露寡糖和抗菌肽单独使用，同时显著降低F/G。本试验研究结果表明，饲粮联合添加抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖显著提高肉仔鸡42日龄体重和1～42日龄ADG，并显著降低22～42日龄和1～42日龄F/G，对提高肉仔鸡的生长性能有积极的影响。这一试验结果证明了饲粮联合添加抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖对肉仔鸡的促生长作用。这可能与抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖参与养分代谢有关。抗菌肽含有小分子多肽及未知生长因子等多种生物活性物质，可提高肠道消化吸收[14]，而酸化剂可通过降低肠道pH，促进肠道消化[15]，功能性寡糖能够通过提高肠道消化酶活性，提高饲料的消化率[16]。最终，这些有益作用都将反映到生长性能。抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖都具有提高肠道消化吸收的能力，组合添加存在一定的协同作用，从而提高了肉仔鸡的生长性能。

3.2 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对42日龄肉仔鸡血清免疫指标的影响

禽类有3种免疫球蛋白，即IgA、IgG和IgM[17]。这3种免疫球蛋白是介导体液免疫的主要抗体，也是衡量免疫功能的重要指标，其水平越高则免疫功能越强[18]。吴东等[19]研究发现，抗菌肽可以显著提高肉仔鸡血清IgA和IgG含量。田丽娜等[20]报道，饲粮添加抗菌肽Sublancin可以显著提高蛋鸡血清IgA、IgG和IgM含量，增强机体免疫力。本试验研究结果显示，饲粮联合添加抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖可以提高肉仔鸡血清免疫球蛋白含量。其中抗菌肽分别与酸化剂和功能性寡糖组合使用的血清IgA含量显著高于酸化剂与功能性寡糖组合，血清IgG含量显著高于三者合用的组合，达到了添加抗生素的效果，在血清免疫指标方面效果较好，能够有效提高肉仔鸡的免疫性能。分析原因可能是抗菌肽中所含的生物活性物质可以有效调节机体的免疫系统[14]，促进免疫球蛋白的合成[21]；也可能是抗菌肽分别与酸化剂和功能性寡糖的协同作用导致，目前联合使用的研究较少，具体机制需要开展进一步深入研究。

3.3 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对42日龄肉仔鸡肠道形态的影响

肠道形态学已经成为评估肠道营养效果的常用研究工具[22]。肠道的形态变化可以揭示肠道的健康状况[23]，同时它的绒毛高度、隐窝深度及其二者比值是反映肠道结构完整性的重要指标[24]。王建[25]在肉仔鸡饲粮中添加抗菌肽Api-PR19，结果显著改善了21日龄空肠和42日龄十二指肠的绒毛高度和V/C。白洁[26]研究发现，肉仔鸡饲粮添加100 mg/kg壳寡糖能够显著提高空肠绒毛高度和V/C，并且显著降低隐窝深度。Giannenas等[27]在肉仔鸡饲粮中添加0.3%苯甲酸，结果能显著提高肉仔鸡空肠绒毛高度。本试验研究结果表明，饲粮联合添加抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖可以显著降低十二指肠和回肠隐窝深度，并显著提高十二指肠和回肠V/C。这一试验结果证明了联合添加抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖对肉仔鸡肠道形态的改善作用。Xiao等[28]报道，抗菌肽通过抑菌或杀菌作用，减少有害菌对肠黏膜的破坏，从而改善肠道黏膜形态。黄灵杰等[29]研究发现，饲粮添加苯甲酸可以降低肠道pH，增加机体细胞分裂，提高绒毛高度，改善肠道形态。黄永洁[30]研究表明，功能性寡糖也能防止肠黏膜上皮细胞萎缩，有利于保持肠黏膜上皮的完整性，改善肠道结构。以上研究结果说明，抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖都具有促进肠道发育的能力，联系到本试验生长性能，进而提高其消化吸收能力，联合添加在一定程度上改善了肉仔鸡的肠道形态发育，促进了肉仔鸡的健康生长。

3.4 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加对42日龄肉仔鸡盲肠微生物区系的影响

肠道微生态系统是影响动物消化吸收能力的重要因素，肠道菌群平衡有助于提高动物的消化吸收能力[31]，有利于保持动物机体的健康[32]。在alpha多样性分析中发现，抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加在饲粮中都能够对盲肠微生物的多样性有一定的改善作用，且抗菌肽与功能性寡糖组合添加的Shannon指数显著高于三者合用，有较高的群落多样性。鸡的盲肠微生物在门水平上，厚壁菌门和拟杆菌门构成了大多数微生物群落，它们在能量的产生和代谢中起着重要作用[33-35]，这与本研究结果相一致。本试验研究结果表明，厚壁菌门和拟杆菌门是肉仔鸡肠道内相对丰度比例较高的菌群。在属水平上，有研究发现，瘤胃球菌科UCG-014具有抗炎性的功能，能起到降低和改善肠道炎症的作用[36]；互养菌属在反刍动物肠道中可以抑制饲粮中毒素的作用，稳定肠道内环境[37]；据报道，脱硫弧菌属与肠炎、肠癌以及某些代谢疾病发生有关[38]，毛螺菌科与人类疾病有关，如腹腔疾病和溃疡性结肠炎[39]。本试验研究结果发现，抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖两两组合与NC组相比增加了肉仔鸡盲肠中瘤胃球菌科UCG-014、脱硫弧菌属和互养菌属的相对丰度，降低了未培养细菌f毛螺菌科的相对丰度。抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖都具有限制病原菌增殖和稳定肠道菌群的优点[21,40-41]，联合添加在改善动物肠道微生物平衡方面具有协同作用，改善了肉仔鸡盲肠微生物多样性和菌群丰度，促进了肠道健康。

4 结 论

① 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加可以提高肉仔鸡后期和全期生长性能，同时也提高了血清免疫球蛋白含量，增强了机体的免疫。其中抗菌肽分别与酸化剂和功能性寡糖组合添加增强机体免疫性能方面效果较好，优于抗生素组，具有替代抗生素的潜质。

② 抗菌肽、酸化剂和功能性寡糖联合添加可以改善肉仔鸡小肠肠道形态，提高盲肠微生物多样性，调节肉仔鸡盲肠微生物的菌群丰度，促进肠道健康。