硒代蛋氨酸对种公鸡睾丸基因差异表达的影响及功能预测分析

衡 诺 马 鑫 郭 勇 齐晓龙* 盛熙晖 王相国 邢 凯 肖龙菲 陈 余 王 梁 倪和民

(1.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206；2.北京市畜牧总站，北京 100107)

硒是动物体内的必需微量元素，影响动物的繁殖力和生产力[1]。研究表明，硒是生物体内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性中心，其抗氧化作用可消除因自由基造成的氧化损伤，保护体内细胞的正常生理功能，从而改善动物繁殖性能[2]。目前，关于有机硒对种公畜禽繁殖性能的影响主要集中在对精子活力的研究上，但对于有机硒组和不添加硒组间的睾丸组织转录组测序方面的研究鲜有报道[3-4]。饲粮中添加适量的硒可以增强畜禽繁殖性能，然而关于有机硒是否能够调控分子层面进而增强其繁殖性能尚不明确[5-6]。本课题组前期通过比较饲粮中添加不同水平的硒代蛋氨酸对种公鸡繁殖性能的影响，发现饲粮中添加硒水平为1 mg/kg的硒代蛋氨酸能提高种公鸡的繁殖性能，且血浆中生殖激素含量最高[7]。本试验以此为基础，选用378日龄蛋用种公鸡为研究对象，通过转录组测序的方法，挖掘种公鸡睾丸组织中显著差异表达的基因并对其功能进行预测分析，旨在探讨硒提高种公鸡繁殖能力的作用机制，为后续提高种公鸡繁殖性能的营养调控提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料和基础饲粮

选取120只378日龄健康、体况一致的罗曼褐蛋用种公鸡为试验动物。所用硒代蛋氨酸中硒的含量是0.2%。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.2 试验设计

本试验采用单因素试验设计，将120只种公鸡随机分为2个组，每组6个重复，每个重复10只鸡。对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中添加硒水平为1 mg/kg的硒代蛋氨酸。试验预试期1周，正试期4周。试验用种公鸡均采用单笼饲养，自由采食和饮水，光照采用每天13 h光照和11 h黑暗。

1.3 睾丸样本采集和总RNA提取

试验期末，每个重复任选取1只种公鸡，参照动物福利对其处死后取出左侧睾丸，减去附睾并剥离睾丸质膜，分装于1.5 mL的离心管中，在-80 ℃冰箱内保存，用于转录组测序。睾丸组织采用Trizol法，按照总RNA提取试剂盒说明书进行操作，操作过程中所有直接接触样本的设备均采用紫外光照30 min以上。采用微量紫外分光光度计(Nanodrop 2000)计算出提取的RNA浓度及260和280 nm的吸光度(OD)值(OD260 nm/OD280 nm读数在1.8～2.2时表明RNA质量最好)，使用Agilent Bioanalyzer 2100系统的RNA 6000 Nano分析试剂盒来评估RNA样本的完整性。测定完毕后，将剩余的RNA样本进行分装，编号置于-80 ℃冷藏，之后将睾丸组织样本送于北京百迈客生物科技有限公司进行睾丸转录组测序。

1.4 转录组测序的文库准备

RNA样本检测合格后，进行文库构建，主要流程如下：用多聚T寡糖磁珠富集真核生物mRNA，将mRNA随机打断并以mRNA为模板，用六碱基随机引物生成第1条cDNA；随后加入缓冲液、DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymerase Ⅰ)、核糖核酸酶H(RNase H)和核苷三磷酸(dNTPs)生成第2条cDNA；利用AMPure XP磁珠纯化cDNA后对cDNA进行末端修复，加A尾并连接测序接头；用AMPure XP磁珠对文库进行片段大小筛选；通过PCR富集得到cDNA文库。文库构建完成后，使用Qubit 2.0以及Agilent Bioanalyzer 2100对文库的浓度和插入片段大小进行检测。

1.5 测序、数据处理以及功能预测分析

检验合格的文库在cBot Cluster生成系统上进行簇的生成，用Illumina HiSeqTM2500上机测序，测序长度为PE100。利用TopHat2序列比对软件将测序读长(reads)与参考基因组进行比对[8]，生成成对的端读。之后进行插入片段长度检验、随机性检验等测序文库质量评估、表达量分析、新基因发掘和基因结构优化等。根据Reference genome对完全匹配或1个不匹配的序列进行分析和注释，采用Hisat2工具软件绘制参考基因组。基于以下数据库对基因功能进行注释：Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO。根据基因在不同样本中的表达量进行差异表达分析、差异表达基因功能注释和功能富集等生物信息学分析。

1.6 相对荧光定量PCR验证

根据睾丸转录组测序结果，随机挑选6个基因进行相对荧光定量PCR验证。PCR验证所使用的cDNA模板均由转录组测序使用的剩余的RNA样本反转录而来，以减少试验误差。试验采用三步法进行相对荧光定量PCR反应，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量，即试验组的目的基因相对于对照组的表达量。引物序列见表2。

表2 引物序列

1.7 数据统计分析

试验数据采用SPSS 20.0软件Student’st检验进行统计分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 鸡睾丸RNA质量检测结果

由表3可知，所测各样本RNA浓度≥802.3 ng/μL，RNA总量≥20.1 μg，RNA完整值(RIN)≥7.00，且1.98≤OD260 nm/OD280 nm≤2.08。因此，各样本检测结果均为合格，质量满足建库要求。利用AMPure XP磁珠评估RNA片段大小，各样本均在18S和28S时峰值较高，且没有残缺部分，质量符合要求，可进行后续上机操作。

表3 鸡睾丸RNA质量检测结果

2.2 测序质量控制结果

由表4可知，经过严格的筛选和控制后总共得到100.28 Gbp高质量reads碱基总数，所有样本的碱基质量值≥30的碱基百分比(Q30)均≥95.20%，且平均每个样本得到28 055 741个高质量reads。

表4 测序质量控制结果

2.3 比对效率统计结果

由表5可知，各样本的reads与参考基因组序列的比对效率为89.78%～90.96%，与参考基因组唯一对应位置的比对效率为85.16%～86.45%，与参考基因组多处对应位置的比对效率在4.42%～4.67%。

表5 比对效率统计结果

2.4 差异表达基因分析结果

如图1所示，通过对所有基因挖掘分析，发现2组中基因重复性表达程度很高，有12 934个基因在2组中共同表达，仅有少数基因在各组中单独表达，其中对照组中单独表达的基因数有570个，试验组中单独表达的基因数有587个。结果说明2组中睾丸组织样本的基因表达保守，可以对重复性表达的基因进行差异表达分析。

图1 表达基因集维恩图

2.5 基因表达量总体分布

基于所选参考基因组序列，对照组中平均比对到的对应读长(mapped reads)个数为49 406 641个，试验组中平均比对到的mapped reads个数为52 085 792个，总共挖掘到新基因的个数为14 212个。如图2所示，各样本的FPKM(每一百万个比对上参考基因组的reads中映射到外显子的每一千个碱基上的fragment个数)值主要集中在0.1～1.0，且每个样本基因表达量的总体分布大致相同。

GL0-1～GL0-6为对照组样本，GL1-1～GL1-6为试验组样本。

2.6 差异表达基因筛选

基因显著差异表达的条件为差异表达倍数(用|log2FC|表示)>1且P<0.05。结果表明，在2组睾丸组织样本中总共挖掘出111个显著差异表达基因，包括55个上调基因和56个下调基因。在这些差异表达的基因中，上调差异表达倍数最大的基因是微管蛋白alpha-8链(TUBA8A)，下调差异表达倍数最大的基因是钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ样(CAMK4L)(图3)。

图3 差异表达基因火山图

2.7 差异表达基因功能注释结果

由表6可知，通过比对共注释到86个筛选差异表达基因，其中在GO功能数据库中注释到的筛选差异表达基因数目为45个，在KEGG功能数据库中注释到的筛选差异表达基因数目为36个。

表6 差异表达基因功能注释

2.8 差异表达基因的GO功能分析结果

GO功能数据库主要划分为3类：生物学过程、细胞组分和分子功能。将注释到的差异表达基因进行GO功能富集分析，发现基因可能通过调控细胞过程、单生物过程、生物调节、代谢过程、细胞成分组织或生物发生、多细胞生物过程、定位、发展历程、细胞、细胞组成、细胞器、膜、细胞器组成、高分子配合物、膜封闭腔、超分子配合物、结合、催化活性和结构分子活性等生物学过程来调控种公鸡的繁殖能力(表7)。

表7 差异表达基因的GO功能分析

2.9 差异表达基因的KEGG通路分析结果

将注释到的差异表达基因进行KEGG通路分析，发现吞噬体(phagosome)通路为富集程度最高的一条通路(表8)。

表8 差异表达基因的KEGG通路分析

distribution of samples

2.10 相对荧光定量PCR验证结果

通过相对荧光定量PCR对选取的6个基因蛋白质chibby同源物1(CBY1)、TUBA8A、ADP核糖基转移酶4(ART4)、钙周期蛋白结合蛋白(CACYBP)、腺苷酸激酶7(AK7)和线粒体核糖体蛋白L17(MRPL17)进行验证。结果表明，相对荧光定量PCR结果与睾丸组织转录组测序结果表达趋势相似，证明了睾丸组织转录组测序结果的可靠性，可以用于后续分析使用(图4)。

CBY1：蛋白质chibby同源物1 protein chibby homolog 1；TUBA8A：微管蛋白alpha-8链 tubulin alpha-8 chain；ART4：ADP核糖基转移酶4 ADP-ribosyltransferase 4；CACYBP：钙周期蛋白结合蛋白 calcyclin binding protein；AK7：腺苷酸激酶7 adenylate kinase 7；MRPL17：线粒体核糖体蛋白L17 mitochondrial ribosomal protein L17。

3 讨 论

本课题组前期通过比较了饲粮添加不同水平硒代蛋氨酸(0、0.25、0.50、1.00和2.00 mg/kg)对种公鸡繁殖性能的影响，结果发现饲粮添加1.00 mg/kg硒代蛋氨酸能够提高种公鸡的繁殖性能和血浆中生殖激素的含量[7]。后续研究发现，饲粮添加1 mg/kg硒代蛋氨酸能够显著提高种公鸡精子密度、精子活率以及精子活力，且能够显著提高精浆中谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性[9]。本试验选用378日龄罗曼褐种公鸡为研究对象，平均分为2组，对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中添加硒水平为1 mg/kg的硒代蛋氨酸。通过对2组种公鸡的睾丸组织样本进行转录组测序，挖掘与繁殖性状相关的差异表达基因并对其功能进行预测分析。高通量测序结果的准确性依赖于碱基质量值和测序获得reads的数量和质量。本试验中，所有样本碱基质量值Q30均≥95.20%，平均每个样本得到reads数量为28 055 741个，说明所选参考基因能够满足后续分析要求。结合GO功能数据库进行比对，发现与繁殖性状相关的分类，如细胞过程、单生物过程、生物调节、代谢过程、细胞成分组织或生物发生等，参与其中的基因有CBY1、ART4、AK7、TUBA8A、MRPL17和CACYBP等。

CBY1基因位于成熟的中心粒中，是纤毛基底体的组成成分，能够促进原发纤毛的形成，并通过β-连环蛋白直接调控拮抗Wnt的典型信号[9-10]。研究表明，硒能够维持精细胞结构和机能完整性并对精细胞的成熟和发育具有关键作用[11]。本试验中，CBY1基因表达呈显著上调，可能通过降低纤毛病的发生，进而提高种公鸡繁殖性能。ART4参与蛋白质ADP糖基化，对DNA的修复损伤发挥着重要作用，能降低染色体重排或细胞死亡的发生[12-13]。研究表明，鸡体内ART4含有与精氨酸特异性的活性位点基序相对应的残基[12,14]，ART4能够提高精氨酸特异性酶活性[9]。精氨酸是精子蛋白的重要组成，具有增加精液品质的作用[15-16]。本课题组前期研究结果表明，饲粮添加1 mg/kg硒代蛋氨酸能够提高种公鸡精子密度、活力和活率。本试验中，ART4基因表达呈显著上调，可能是由于硒代蛋氨酸通过修复DNA损伤和提高精氨酸特异性酶活性进而提高种公鸡精液品质[17]。

AK7在睾丸和纤毛组织中强烈表达且与纤毛、鞭毛的结构和功能相关[18-20]。研究发现，原发性纤毛运动障碍(PCD)患者的AK7表达水平低于健康受试者，并且这种基因的沉默导致纤毛活性显著降低[20]。AK7基因缺失造成小鼠PCD，纤毛超微结构缺陷以及精子发生异常[18,21]。本试验中，饲粮添加1 mg/kg硒代蛋氨酸使得AK7基因表达显著下调，这可能是由于饲粮中添加有机硒提高了组织中谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性，降低了由于氧化损伤造成的原发性纤毛运动障碍，导致AK7表达量下降。

TUBA8A属于α-微管蛋白，是参与构成微管的主要蛋白质。微管参与细胞骨架的动态组成部分，对神经元的形态、功能和存活至关重要[22]；其双螺旋结构具有保持细胞内部稳定、外部形态正常的功能[23-24]。研究表明，硒能够维持精细胞结构和机能完整性[11]。本试验中，饲粮添加1 mg/kg硒代蛋氨酸使得TUBA8A基因表达呈显著上调，这表明硒代蛋氨酸可通过维持精子细胞的正常生理形态，以及在线粒体定位和细胞减数分裂过程中发挥重要作用来提高种公鸡繁殖性能。

MRPL17参与构成核糖体，具有促进线粒体内热休克蛋白60合成的作用[25]。研究表明，热休克蛋白60可参与精子的生成过程，热休克蛋白60的表达不仅受精原细胞有丝分裂过程中活性强弱的影响而且与线粒体活性和种类也相关[26]。Dorji等[27]研究表明，MRPL17调控线粒体核糖体蛋白表达，MRPL17表达上调可促进与发育能力有关的线粒体功能[28-29]。本试验中，MRPL17基因表达量呈显著下调，可能是由于饲粮添加硒代蛋氨酸提高了机体内抗氧化水平，减少了精子线粒体的氧化损伤，从而导致MRPL17表达量下降。

CACYBP是一种参与β-连环蛋白降解的钙信号蛋白[30-31]，其表达受孕酮和β-雌二醇的正调控。CACYBP可能参与了妊娠早期子宫内膜细胞凋亡的调控，并在小鼠子宫内膜中发挥重要的作用，如妊娠期建立等过程[32]。Matsuzawa等[33]研究指出，细胞周期随CACYBP表达的变化而发生改变，当机体内CACYBP表达量下降时，β-连环蛋白降解程度减弱，大量的β-连环蛋白进入细胞核，与T细胞因子/淋巴增强因子转录因子发生生物学反应，诱导细胞增殖；若抑制Ebi基因的生理功能且促进p53基因的表达会引起S期和G2或M期的细胞数量增多和凋亡细胞数量降低的现象，但关于CACYBP调控细胞周期的具体原理尚待研究。CACYBP也能够与微管蛋白相结合，促进细胞骨架的重组[34]。本试验中，CACYBP基因表达量呈显著上升，这表明饲粮添加硒代蛋氨酸能够通过提高CACYBP基因表达量，维持精子细胞稳态，减少精子细胞凋亡，从而提高精液品质。

4 结 论

① 饲粮添加1 mg/kg硒代蛋氨酸后，对照组和硒代蛋氨酸组种公鸡睾丸差异表达基因共有111个，其中有55个上调基因和56个下调基因。

②CBY1、ART4、AK7、TUBA8A、MRPL17和CACYBP等基因可作为研究种公鸡繁殖性能的候选基因并进行进一步地研究和探讨。

③ 从差异表达基因GO功能分类注释结果看，细胞过程、单生物过程、生物调节、代谢过程和细胞成分组织等显著富集基因都与提高繁殖性能相关。