基于转录组分析不同硒源调节黄颡鱼适应低温应激的信号通路及关键基因

胡俊茹 袁夕宸 黄 文 李国立 张羽帆 王国霞 赵红霞 黄燕华*

(1.广东省农业科学院动物科学研究所，农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，广东省动物育种与营养公共实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广州 510640；2.广州飞禧特生物科技有限公司，广州 510640；3.北京奥特奇生物制品有限公司，北京 101499)

鱼类属于变温动物，水温是影响鱼类生理、行为及进化过程中最重要的环境因素[1]。低温应激时，动物可能有不同的营养策略以提高自身的低温适应能力[2]。硒(Se)是动物机体必需的微量元素，具有促生长、抗氧化、提高免疫等功能。硒在体内主要以硒蛋白的形式发挥作用，硒蛋白具有类胰岛素的作用，影响内分泌激素[3]，对促进葡萄糖的摄入、调节糖酵解、糖异生以及脂肪酸的合成具有重要的作用[4]。我们前期研究发现，摄食酵母硒为硒源饲料的黄颡鱼(Pelteobrusfulvidraco)血液中葡萄糖、甘油三酯含量显著高于摄食亚硒酸钠为硒源饲料的黄颡鱼[5]，但是到目前为止这2种硒源发挥作用的分子机制尚不清楚。

转录组是指在特定的发育时期或生理状态下，细胞内所有转录本(transcript)的集合，它能够从整体水平揭示特定生物学过程发生的分子机理，为我们探究动物营养调控与抗环境胁迫机制提供了必要的分子手段[6]。因此，本试验采用转录组测序(RNA-seq)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术挖掘低温应激时摄食酵母硒和亚硒酸钠的黄颡鱼肝脏组织的关键信号通路和基因，为深入研究不同硒源的调控机理奠定基础，也为黄颡鱼抗低温功能饲料的研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

以酪蛋白为蛋白质源，玉米淀粉为糖源，鱼油、磷脂油为脂肪源配制基础饲料，其组成及营养水平见表1。在基础饲料中分别添加亚硒酸钠和酵母硒，硒的实际添加量均为0.23 mg/kg[5]，配制2种试验饲料，添加亚硒酸钠的试验饲料硒含量实测值为0.22 mg/kg，添加酵母硒的试验饲料硒含量实测值为0.21 mg/kg。饲料原料粉碎后过60目筛，各原料采用逐级扩大法混合，然后于NH-10型捏合机中加入鱼油、磷脂油再进行二次混合，使用B20强力搅拌机搅拌均匀至成团，采用SLX-80型双螺杆挤压机制成粒径为2.0 mm的饲料，然后在G-500型造粒机中制粒，制粒完成后放入55～60 ℃烘箱中烘干，随后冷却，筛除粉末，用封口袋分装、标记，置于-20 ℃冰箱中待用。

表1 基础饲料组成及营养水平(干物质基础)

1.2 试验鱼与饲养管理

养殖试验在广东省农业科学院动物科学研究所水产研究室的室内循环水养殖系统中进行。将5.7 g左右的黄颡鱼随机分成2组，每组4个重复，每个重复35尾，以重复为单位放养于水体容积300 L的养殖缸中。2组试验鱼分别投喂添加亚硒酸钠(T1组)和酵母硒(T2组)的试验饲料，每天饱食投喂2次(09:00和18:00)，持续投喂42 d。养殖期间，每天排污1次，每2周换水1次，水温26～30 ℃，pH 7.0～7.5，氨氮含量≤0.2 mg/L，亚硝酸盐含量≤0.02 mg/L，自然光照，24 h不间断曝气，每天记录投喂量和死亡情况。待养殖试验结束，将上述每缸中20尾试验鱼转移至可控温生态水槽系统的养殖缸(每缸水体容积150 L)中，降温前测得水温为26 ℃，降温速度设定为1 ℃/h，连续降温，当水温降到13 ℃时采样，低温应激期间禁食。

1.3 样品采集

低温应激试验结束时每缸随机取3尾试验鱼，用40 mg/L MS-222麻醉后尾静脉取血，用于分析生化和抗氧化指标；然后在无菌环境下解剖取肝脏，装入无酶管，液氮速冻，于-80 ℃保存，用于转录组和基因表达分析。

1.4 RNA的提取及转录组文库的建立

采用TRIzol(Invitrogen)法提取黄颡鱼肝脏中的总RNA，并使用DNase Ⅰ(TaKaRa)去除基因组DNA。分别采用2100 Bioanalyser(Agilent)、ND-2000(NanoDrop Technologies)检测RNA样品的质量，以保证使用合格的样品[OD260 nm/OD280 nm=1.8～2.2，OD260 nm/OD230 nm≥2.0，RNA完整值(RIN)≥6.5，28S/18S≥1.0，总量>2 μg]进行转录组测序。RNA文库的建立采用TruSeqTMRNA Sample Preparation Kit(Illumina)试剂盒。首先利用带有Oligo(dT)的磁珠从1 μg总RNA中富集有poly-A尾的mRNA。再加入Fragmentation Buffer，将mRNA随机断裂成200 bp左右的小片段。接着采用SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit(Invitrogen)试剂盒，加入六碱基随机引物(Illumina)，以mRNA为模板反转录合成第1链cDNA，随后进行第2链合成，形成稳定的双链结构。双链的cDNA结构为黏性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3’末端加上1个A碱基，用于连接Y字形的接头，具体步骤参见试剂盒说明书。cDNA经过PCR富集后，使用DNA Clean Beads筛选200～300 bp的条带。经TBS380(Picogreen)定量后，文库使用Ilumina Noveseq 6000测序平台进行高通量测序，测序读长为PE 150。以上过程由上海美吉生物医药科技有限公司完成测序。

1.5 转录组数据分析

将Ilumina Noveseq 6000测序平台得到的图像文件经CASAVA碱基识别分析转化为原始数据(raw data)，raw data经过去接头、低质量数据过滤筛选等流程后，得到高质量数据(clean data)。对mapped reads进行拼接，并与原有的基因组注释信息进行比较。本研究采用TPM(transcripts per million reads，即每百万reads中来自于某转录本的读段数)方法计算基因的表达量。再利用DEGseq软件包筛选差异表达基因，筛选阀值为差异倍数(fold change)>2和调整后P值(P-adjust)<0.05，且P-adjust越小基因表达量差异越显著。使用Goatools软件对差异表达基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析，且P<0.05时表示差异表达基因显著富集。

1.6 RT-qPCR

根据差异表达基因对低温应激的响应程度，本研究采用RT-qPCR试验对关键通路中的差异表达基因进行验证，以此评价转录组测序技术鉴定差异表达基因的可靠性。使用Primer 3.0对各差异表达基因进行引物设计(表2)，并在上海美吉生物医药科技有限公司完成引物的合成。使用反转录试剂盒(BestarTMqPCR RT Kit)将各样品的RNA反转录为cDNA，并以反转录产物为模板。以18S RNA为内参，并使用ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix(2×)试剂，采用ABI7300荧光定量PCR仪进行定量检测，每个样品3个平行，以减小误差。采用2-△△Ct的方法计算出各候选基因的相对表达量。

表2 RT-qPCR引物

1.7 血清生化和抗氧化指标

血清总蛋白、白蛋白、球蛋白、胆固醇、葡萄糖、甘油三酯含量采用日立全自动生化分析仪进行测定。

血清抗氧化指标均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定，按照使用说明进行操作。

1.8 生长性能指标计算

增重率(%)=100×(终末均重-初始均重)/初始均重；特定生长率(%/d)=100×(ln终末均重-ln初始均重)/养殖天数；饲料系数=投饲总量/(终末体重+死亡体重-初始体重)；存活率(%)=100×终末尾数/初始尾数。

1.9 数据分析

生长性能、血清生化和抗氧化指标数据采用SPSS 17.0软件进行t检验，结果以平均值±标准差(mean±SD)表示，以P<0.05为显著差异水平。

2 结果与分析

2.1 生长性能

由表3可知，与摄食以亚硒酸钠为硒源的饲料相比，摄食以酵母硒为硒源的饲料的黄颡鱼的生长性能无显著变化(P>0.05)，但增重率、特定生长率和存活率有升高的趋势。

表3 摄食不同硒源饲料黄颡鱼的生长性能

2.2 低温应激后血清生化和抗氧化指标变化

由表3可知，与亚硒酸钠相比，低温应激后酵母硒显著提高了黄颡鱼血清甘油三酯含量以及抑制与产生超氧阴离子自由基能力(P<0.05)，显著降低了血清丙二醛含量(P<0.05)。

表4 低温应激后摄食不同硒源饲料黄颡鱼的血清生化和抗氧化指标

2.3 转录组测序数据及比对分析

对T1组和T2组黄颡鱼肝脏组织进行转录组测序，共获得42.00 Gb clean data，各样品的clean data均达到6.68 Gb。测序样品的数据质量及比对结果见表5，各样品的Q30占比均在93%以上，GC含量均在46%以上。将各样品的高质量reads(clean reads)与黄颡鱼基因组进行序列比对，比对率均在66%以上，表明此次测序数据质量较高，可用于后续分析。

表5 测序数据质量和序列比对

2.4 低温应激后差异表达基因分析

基于表达量指标TPM，以fold change的绝对值>2，P-adjust<0.05为阈值，对同一基因在不同组的表达量进行统计分析。与T1组相比，T2组有76个基因表达量上调，71个基因表达量下调，差异表达基因如图1所示。

图1 差异表达基因火山图(T1组vs.T2组)

2.5 低温应激后差异表达基因的GO功能注释及富集分析

Unigene在GO分类中被注释到生物过程、细胞组分和分子功能等3大类别中。与T1组相比，T2组肝脏基因表达谱主要与代谢过程、催化活性、结合、单组织过程、细胞进程等生物功能有关(图2)，显著富集到蛋白质水解作用、水解酶活性、肽酶活性、肽链内切酶活性、羧肽酶活性、蛋白质代谢过程(图3)。

X轴为注释的基因/转录本数量，Y轴为GO term，图中显示的是丰度前20个GO term。X-axis was the annotated number of genes/transcripts, and Y-axis was GO term.The figure showed the top 20 GO terms of abundance.

X轴为富集的基因/转录本数量，Y轴为GO term，图中显示的是P-adjust最小的前20个GO term。X-axis was the enriched number of genes/transcripts, and Y-axis was GO term.The figure showed the top 20 GO terms with the smallest P-adjust.

2.6 低温应激后差异表达基因的KEGG功能注释及富集分析

Unigene在KEGG分类中被注释到代谢、环境信息处理、细胞过程、生物体系统、人类疾病等五大类别中。与T1相比，T2组差异表达基因主要注释到消化系统、信号分子与相互作用、信号传导、脂代谢、内分泌系统、免疫系统、糖代谢、氨基酸代谢、运输和分解代谢通路(图4)，显著富集到胰腺分泌、蛋白质消化吸收、脂肪消化吸收、花生四烯酸代谢及醚脂类代谢通路(图5)。

X轴为KEGG通路，Y轴为注释的基因/转录本数量。图中显示的是注释到的KEGG通路。X-axis was KEGG pathways, and Y-axis was the annotated number of genes/transcripts.The figure showed the annotated KEGG pathways.

X轴为富集的基因/转录本数量，Y轴为KEGG通路。图中显示的是所有富集的KEGG通路。X-axis was the annotated number of genes/transcripts, and Y-axis was KEGG pathways.The figure showed all the KEGG pathways.

2.7 低温应激后差异表达基因的分析及验证

如表6所示，胰腺分泌、蛋白质消化与吸收、脂肪消化与吸收、花生四烯酸代谢、醚脂代谢等通路的类胰蛋白酶-1、羧肽酶A1、羧肽酶B、磷脂酶A2等关键基因的表达都显著上调。利用RT-qPCR对蛋白质消化与吸收通路差异表达基因硒蛋白M、磷脂酶A2、羧肽酶A1、类胰蛋白酶-1、胰凝乳蛋白酶样弹性蛋白酶家族成员2A的结果进行验证，结果中表达显著上调的基因其验证结果也为表达显著上调，表明基于转录组测序数据的差异表达基因分析结果可信(表7)。

表6 低温应激后相关差异表达基因的表达

表7 差异表达基因的qRT-PCR分析

3 讨 论

生长性能结果显示，酵母硒组黄颡鱼的生长性能优于亚硒酸钠组，这一结果与我们前期开展的8周养殖试验获得的结果[5]一致，同样，低温应激后血清谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛以及抑制与产生超氧阴离子自由基所反映的抗氧化能力提高也与前期研究结果[5]一致。

温度作为对鱼体最重要的影响因素之一，对鱼体自身的新陈代谢起着至关重要的作用。随着水温的持续降低以及应激时间的延长，鱼体内环境出现紊乱。研究显示，部分鱼类承受低温应激能力较强，最终可通过自身调节系统使机体适应外界环境的变化，以维持或重建鱼体内环境的稳态，从而减少或避免应激造成的损伤；但一部分鱼类自身抵抗力差，持续的低温应激对自身机体耗能过多，其自身的调节系统不足以使机体内环境再次达到稳定平衡的状态，最终鱼类自身调节系统衰竭，造成死亡[7]。鱼类的内分泌机能以及蛋白质、脂肪和糖类等营养物质的代谢对低温应激敏感[2,8-9]，低温应激从多方面影响鱼类的生理活动，显然单独研究某个或某些基因不能揭示信号调控网络的复杂性，转录组测序技术为我们从整体水平揭示特定生物学过程发生的分子机理提供了研究手段。

本研究通过转录组分析发现酵母硒组与亚硒酸钠组之间共产生了147个差异表达基因，GO功能注释表明，差异表达基因的功能主要在蛋白质水解作用、催化活性(作用于蛋白质)、水解酶活性、肽酶活性、水解酶活性(作用于酸性磷氮键)、肽链内切酶活性、蛋白质代谢过程、脂质分解过程富集，KEGG功能注释显示差异表达基因主要注释到消化系统、信号分子与相互作用、信号传导、脂代谢、内分泌系统、免疫系统、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、运输和分解代谢通路，并显著富集到胰腺分泌、蛋白质消化吸收、脂肪消化吸收、花生四烯酸代谢、醚脂类代谢。上述结果表明，与亚硒酸钠比较，酵母硒激活了内分泌，蛋白质、氨基酸、脂肪和糖类代谢等多个生物学过程，以调节黄颡鱼适应低温应激。鱼类为了适应环境胁迫，机体表现出神经内分泌活动的改变，低温应激改变了水产动物的内分泌系统[10-11]，当虹鳟(Oncorhynchusmykiss)处于急性低温胁迫时，正常的甲状腺功能降低[12]。硒具有调节机体内分泌激素的作用，硒蛋白P和谷胱甘肽过氧化物酶与胰岛β细胞的功能有关，具有降低血糖和调控胰岛素介导的代谢过程等拟胰岛素作用[13]，而碘甲腺原氨酸脱碘酶能够介导甲状腺激素的形成和降解，具有调节甲状腺激素代谢平衡的作用[14]。本试验中，低温应激后酵母硒组的黄颡鱼肝脏中23个差异表达基因富集在胰液分泌通路且显著上调，这一结果也证明硒参与了黄颡鱼低温应激时的内分泌调控，与前述研究结果一致。有机硒的吸收效率和生物利用率高于无机硒[5,15-16]，这可能是导致酵母硒组黄颡鱼内分泌通路显著上调的原因，这也恰恰说明当黄颡鱼处于低温应激状态时，饲料中添加酵母硒能够增强黄颡鱼低温应激时的内分泌机能，提高黄颡鱼的抗寒能力。

胰腺分泌的有机物是多种消化酶，可作用于糖类、脂肪和蛋白质的转运及消化过程[17-18]，其中胰腺脂肪酶包括甘油三酯脂酶、磷脂酶A2等，是主要的脂肪消化酶[19-20]。李敏芬[21]研究发现，急性低温胁迫时乌鳢(Channaargus)和乌斑鳢(Channamaculata)的脂肪酶活性显著上升，推测乌鳢及乌斑鳢对低温的适应性可能较好。此外，在暗纹东方鲀(Takifugufasciatus)[22]、斑马鱼(Daniorerio)[23]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[24]、金头鲷(Sparusaurata[25]、鲤鱼(CyprinuscarpioL.)[26]等鱼类中发现低温下脂类代谢增强，脂类代谢通路在鱼类应对低温时发挥了关键作用。本试验中，酵母硒提高了胰液分泌通路上胰腺三酰甘油、磷脂酶A2、羧基酯脂肪酶的表达，同时脂肪消化与吸收通路显著富集，血清甘油三酯含量显著升高。羧基酯脂肪酶主要参与消化甘油三酯，为生命提供能量的物质，说明酵母硒提高了黄颡鱼的脂肪分解供能能力，为机体积极应对低温应激提供热量。研究显示，酵母硒本身具有显著提高鳡鱼(Elopichthysbambusa)[27]、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[28]、刺参(Apostichopusjaponicas)[29]脂肪酶活性的能力，本研究结果与此一致。然而，在我们前期进行的8周养殖试验的低温应激结果中，酵母硒组和亚硒酸钠组黄颡鱼血清甘油三酯含量并未出现显著差异[5]。鱼体的应激调控系统是一个多层次、多功能的结构体系[30]，动物的分子响应与代谢产物产生的时空特性还有待于进一步研究。

蛋白质作为体内重要的营养物质，首先在胃和肠道中被胃蛋白酶、胰蛋白酶以及肽酶等降解生成肽类物质和游离氨基酸。动物在面临低温应激时自动分解的氨基酸，一方面用于蛋白质的合成与周转，另一方面还可能承担着抗应激的功能[2]。研究发现，凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)在低温应激时肝胰腺启动了蛋白质的分解机制以弥补体内氨基酸的缺乏[31]，鳢在短时间低温胁迫时胰蛋白酶活性显著升高，通过消耗机体蛋白质来应对低温胁迫[21]。本试验结果显示，有18个差异表达基因显著富集在蛋白质消化与吸收通路，该通路中类胰蛋白酶-1、胰凝乳蛋白酶样弹性蛋白酶家族成员2A、羧肽酶A1和羧肽酶B的表达量在酵母硒组显著上调，表明酵母硒促使黄颡鱼在低温应激时蛋白质分解作用增强。本试验中酵母硒组黄颡鱼血清总蛋白含量高于亚硒酸钠组，但差异不显著。目前，硒影响动物蛋白质代谢的报道主要集中在正常养殖环境下硒促进蛋白质合成方面，例如，酵母硒通过提高虹鳟肌肉的生长以及肌肉蛋白质的含量实现生长[32-33]；硒激活胰岛素信号级联和调节蛋白质代谢，有利于骨骼肌发育[34]；母体补硒提高肉鸡雉鸡胸肌含量以及雷帕霉素的基因表达等[35]。但有关硒影响蛋白质水解生成氨基酸的研究鲜有报道。

糖类是低温应激下鱼类的重要能源物质，机体为了抵御寒冷，可能会加快糖的分解利用。研究认为，在应激初期，糖原转化成葡萄糖的速率加快，血糖水平上升；在应激后期，血糖被大量分解生成ATP，以给机体提供能量，此时血糖水平会降低[36]。鲤鱼、在急性低温胁迫时糖酵解/糖质新生过程被显著富集，关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PC)、果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PCK)的基因表达量在鲤低温适应过程中均显著升高[37]。然而，本试验条件下未筛选到糖代谢通路。在我们的前期研究中发现当温度下降到13℃时酵母硒组黄颡鱼血清葡萄糖含量高于亚硒酸钠组且达到显著水平[5]，在此次试验中酵母硒组血清葡萄糖含量也高于亚硒酸钠组，但未达到显著水平。因此，本试验中导致糖代谢通路未被注释和富集的原因需要进一步研究。

硒蛋白M是一种内质网硒蛋白，具有维持机体氧化还原水平、保护神经细胞和调节钙稳态平衡等重要作用。研究发现，凡纳滨对虾通过RNA干扰RNAi沉默硒蛋白M会降低鳃部过氧化物酶的活性，硒蛋白M是调节鳃氧化应激的关键酶，可以作为肝胰腺的第二信使调节因子在氧化还原系统中发挥作用[38]。当外源性能源的获取受到抑制时，机体需要动员更多的内源性能源物质或潜在产能底物来提供能量应对低温环境，更多参与转录正调控、信号转导、能量代谢、内分泌等生理活动的基因表达激活、上调都有助于对低温环境的适应[38]。本研究中，酵母硒组黄颡鱼肝脏硒蛋白M的表达显著上调，推测酵母硒可能通过提高硒蛋白M的表达进而上调胰腺分泌、蛋白质消化与吸收、脂肪消化与吸收等通路关键基因的表达，发挥酵母硒优于亚硒酸钠抗低温应激的效果。

4 结 论

与亚硒酸钠相比，酵母硒可能通过提高黄颡鱼硒蛋白M的表达，上调胰腺分泌、蛋白质消化与吸收、脂肪消化与吸收、花生四烯酸代谢、醚脂代谢等通路中胰蛋白酶、羧肽酶、磷脂酶、羧基酯脂肪酶等关键基因的表达，进而提高黄颡鱼的抗低温应激能力。