固相萃取-反相高效液相色谱法测定蛋黄中的斑蝥黄

王凤芹 刘 鑫 程远之 郭冠群 路则庆 汪以真

(浙江大学饲料科学研究所，农业农村部(华东)动物营养与饲料重点实验室，浙江省饲料与动物营养重点实验室，杭州 310058)

鸡蛋是许多国家重要的食物之一，鸡蛋除了含有蛋白质、脂肪等常规营养物质外，还含有类胡萝卜素，类胡萝卜素在蛋黄中沉积赋予其金黄色或橙色[1]。斑蝥黄化学名称为β,β-胡萝卜-4,4-二酮，主要有全反式(图1)和顺式(图2)2种异构体[2]，它作为一种重要的类胡萝卜素类红色色素，被用作禽类的着色剂，以增强禽类皮肤、肌肉以及蛋黄的颜色[3]。除此之外，就像其他类胡萝卜色素一样，它还是一种有效的抗氧化剂[4]，但是摄取过量的斑蝥黄可能在人和动物的视网膜上沉积，导致视觉问题[5]。为此，欧洲食品安全局和日本厚生劳动省规定了蛋黄中斑蝥黄的最高残留限量分别为30和25 μg/g[6]。因此，有必要建立针对蛋黄中斑蝥黄的定量检测方法，为禽蛋质量安全风险监测提供依据，继而可以为社会关切的“化妆的土鸡蛋”进行准确地质量评价，为养殖场科学、合理使用色素添加剂提供指导。

图1 全反式斑蝥黄的化学结构

图2 9-顺式斑蝥黄的化学结构

目前，对于禽蛋蛋黄中斑蝥黄残留的检测尚无相应的标准方法。文献报道的方法主要有高效液相色谱(HPLC)法[7-9]、高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)法[2,10-11]。基于高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法分析蛋黄中斑蝥黄的仪器方法已经很成熟，但是往往忽略了对斑蝥黄顺反异构体的定量[1,12-13]，而据文献报道，斑蝥黄顺式异构体较全反式异构体具有更强的抗氧化性能[14]。另外，减少蛋黄中脂类物质的干扰以获得较高的回收率、简便的提取和净化方法，从而建立准确、快速的蛋黄中斑蝥黄顺反异构体定量分析方法则是一项挑战。

蛋黄中脂类物质的去除主要有以下3种途径。皂化法：Larsen等[15]使用氢氧化钾的甲醇溶液提取叶黄素类物质，但是皂化过程会导致色素降解[2]，因此该方法在后续文献中较少报道。固相萃取(SPE)法：先使用有机溶剂从样品基质中提取斑蝥黄，比较常见的溶剂有乙腈[16-17]、甲醇[12]、丙酮[12]、石油醚-甲醇-乙酸乙酯混合溶液[9]、乙腈-乙酸乙酯混合溶液[13]以及无水乙醇-二氯甲烷混合溶液[18]等，随后经C18-SPE、硅胶-SPE、氰丙基-SPE、中性氧化铝-SPE净化[1,6]。上述乙酸乙酯和二氯甲烷等提取体系对蛋黄中斑蝥黄提取完全，但萃取液中含有大量的脂类物质，造成了固相萃取柱堵塞，明显导致斑蝥黄的回收率过低；此外，净化过程将斑蝥黄提取液经过C18-SPE、硅胶-SPE、氰丙基-SPE以及中性氧化铝-SPE等固相萃取柱净化，大都采用复杂的活化、平衡步骤，在真空泵下操作，费时费力。液液萃取法：采用正己烷等非极性溶剂分次对蛋黄的乙腈提取液进行萃取除脂[17]。乙腈对蛋黄中的斑蝥黄具有很好的提取效率，采用正己烷分次萃取除脂，虽然成本低，但是有机溶剂消耗量大，正己烷在萃取除脂的过程中造成了部分斑蝥黄损失，也导致斑蝥黄回收率偏低。

针对现有蛋黄中斑蝥黄检测方法前处理方法复杂、因脂类物质干扰而导致回收率较低、不能对斑蝥黄顺反异构体同时定量的问题，本试验选用乙腈超声提取蛋黄中斑蝥黄，取部分提取液与水混合后直接通过PRiME HLB固相萃取柱净化，浓缩后由反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测，该方法较上述方法易于操作且回收率高，可实现对蛋黄中斑蝥黄的快速、准确定量。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 鸡蛋

从综合性大型超市采购新鲜白鸡蛋、红鸡蛋、五谷蛋和土鸡蛋各10枚。

1.1.2 试剂

1.1.3 主要仪器

高效液相色谱仪(e2695，美国Waters公司)、超声波清洗器(KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司)、纯水仪(Millipore，德国EMD Millipore公司)、电子分析天平(ME204E，瑞士Mettler Toledo公司)、离心机(ST 40R，美国Thermo Scientific公司)、氮吹仪(N-EVAP 112，美国Organomation公司)。

1.2 色谱分析条件

Welch C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，上海月旭公司)；进样量20 μL；流动相为乙腈-水(95∶5，体积比)；流速：1.2 mL/min；柱温：30 ℃；二极管阵列检测器：波长474 nm。

1.3 标准曲线的制备

称取斑蝥黄62.5 mg(精确到0.000 1 g)，用二氯甲烷溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，混匀，配制成浓度为1 250 μg/mL的斑蝥黄标准储备溶液。分装后于-18 ℃保存。

准确移取1 250 μg/mL的斑蝥黄标准储备溶液，用乙腈配制成浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 μg/mL的标准工作溶液。现配现用。

1.4 样品的提取与净化

1.4.1 乙腈提取HLB固相萃取柱净化(ACN-SPE)

取新鲜鸡蛋，分离出蛋黄，随后将蛋黄混合均匀，再称取5 g(精确至0.00 1 g，置于50 mL离心管中，并加入10 g无水硫酸钠和20 mL乙腈，用玻璃棒充分搅拌，混合均匀，超声提取10 min，再以5 000×g离心10 min，将提取液收集至50 mL容量瓶中。沉淀用20 mL乙腈重复提取、离心，合并提取液于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，备用。准确移取5 mL提取液至10 mL离心管中，再加入5 mL水，超声混匀后过PRiME HLB固相萃取柱，向离心管中先后加入1 mL乙腈和1 mL水，洗涤离心管，洗涤液一并过柱。用5 mL乙腈水溶液(1∶1，体积比)淋洗固相萃取柱，最后用3 mL乙腈洗脱，收集洗脱液于50 ℃氮气吹干，准确加入0.5 mL乙腈溶解残渣，以5 000×g离心5 min，取上清液上机测定。做3次平行测定。

1.4.2 乙腈提取正己烷分次萃取(ACN+n-Hexane)

取新鲜鸡蛋，分离出蛋黄，随后将蛋黄混合均匀，再称取5 g(精确至0.00 1 g)于50 mL离心管中，加入10 g无水硫酸钠和20 mL乙腈，用玻璃棒充分搅拌，混合均匀，超声提取10 min，再以5 000×g离心10 min，将提取液用20 mL乙腈饱和的正己烷萃取，收集乙腈相至50 mL容量瓶中，沉淀重复提取1次，合并乙腈相于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，备用。准确移取5 mL提取液至10 mL离心管中，50 ℃水浴氮吹浓缩至干，准确加入0.5 mL乙腈溶解残渣，以5 000×g离心5 min，取上清液上机测定。做3次平行测定。

1.4.3 乙腈-乙酸乙酯提取HLB固相萃取柱净化(ACN+EA-SPE)

取新鲜鸡蛋，分离出蛋黄，随后将蛋黄混合均匀，再称取5 g(精确至0.001 g，置于50 mL离心管中，并加入10 g无水硫酸钠和20 mL乙腈-乙酸乙酯(1∶1，体积比)，用玻璃棒充分搅拌，混合均匀，超声提取10 min，再以5 000×g离心10 min，将提取液收集至50 mL容量瓶中。沉淀重复提取1次，合并提取液于容量瓶中，并用提取溶剂定容至刻度，摇匀，备用。准确移取5 mL提取液至10 mL离心管中，50 ℃水浴氮吹浓缩至干，加入5 mL乙腈，超声15 s，再加入5 mL水，超声混匀过PRiME HLB固相萃取柱，向离心管中先后加入1 mL乙腈和1 mL水，洗涤离心管，洗涤液一并过柱。用5 mL乙腈水溶液(1∶1，体积比)淋洗固相萃取柱，抽干淋洗液，用3 mL乙腈洗脱，收集洗脱液于50 ℃氮气吹干，准确加入0.5 mL乙腈溶解残渣，以5 000×g离心5 min，取上清液上机测定。做3次平行测定。

1.4.4 无水乙醇-二氯甲烷提取HLB固相萃取柱净化(Ethanol+DCM-SPE)

取新鲜鸡蛋，分离出蛋黄，随后将蛋黄混合均匀，再称取5 g(精确至0.001 g，置于50 mL离心管中，并加入10 g无水硫酸钠和20 mL无水乙醇-二氯甲烷(体积比，1∶1)，用玻璃棒充分搅拌，混合均匀，超声提取10 min，再以5 000×g离心10 min，将提取液收集至50 mL容量瓶中。沉淀重复提取1次，合并提取液于容量瓶中，并用相应的提取溶剂定容至刻度，摇匀，备用。准确移取5 mL提取液至10 mL离心管中，50 ℃水浴氮吹浓缩至干，加入5 mL 乙腈，超声15 s，再加入5 mL水，超声混匀过PRiME HLB固相萃取柱，向离心管中先后加入1 mL乙腈和1 mL水，洗涤离心管，洗涤液一并过柱。用5 mL乙腈水溶液(1∶1，体积比)淋洗固相萃取柱，抽干淋洗液，用3 mL乙腈洗脱，收集洗脱液于50 ℃氮气吹干，准确加入0.5 mL乙腈溶解残渣，以5 000×g离心5 min，取上清液上机测定。做3次平行测定。

1.5 加标回收率试验

筛选不含斑蝥黄的鸡蛋——空白鸡蛋，分离出蛋黄，随后将蛋黄混合均匀，再称取5 g(精确至0.00 1 g)，置于50 mL离心管中，并加入10 g无水硫酸钠，再向其中分别加入0.2 mL浓度分别为1.25、25.00和100.00 μg/mL的斑蝥黄标准溶液，使蛋黄中斑蝥黄加标浓度分别为0.1、1.0和4.0 μg/g，按1.4步骤提取与净化，计算回收率及相对标准偏差。

1.6 其他色素干扰性试验

制备虾青素、玉米黄质、叶黄素、斑蝥黄、β-阿朴-8′-胡萝卜素醛、β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯混合标准溶液(0.1～0.5 μg/mL)，上机测定，以考察上述色素的色谱分离情况。

1.7 斑蝥黄检测方法的应用

对所采购的白鸡蛋、红鸡蛋、五谷蛋和本鸡蛋，采用1.4.1试验步骤进行前处理并采用高效液相色谱仪分析其斑蝥黄含量。

1.8 定性与定量

以斑蝥黄异构体的紫外-可见吸收光谱图做比对，进行进一步的组分定性；统计色谱图中斑蝥黄顺反异构体峰面积总和，根据斑蝥黄标准曲线方程，采用外标法对样品中斑蝥黄进行定量[2]。

试样中斑蝥黄的含量(顺反式斑蝥黄总量)以质量分数(w)表示，数值以微克每克(μg/g)表示，按下式计算：

w=(ρ×V×V2×n)/(m×V1)。

式中：ρ表示由标准工作曲线得到的试样溶液中斑蝥黄的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；V表示提取液的定容体积，单位为毫升(mL)；V1表示用于净化的提取液体积，单位为毫升(mL)；V2表示净化后最终定容体积，单位为毫升(mL)；n表示稀释倍数；m表示试样的质量，单位为克(g)。

1.9 数据处理与分析

数据处理采用Excel 2020统计分析软件进行处理和计算，结果以平均值来表示。

2 结果与分析

2.1 方法的线性范围

按1.3步骤进行处理，以斑蝥黄的标准溶液浓度为横坐标(x)，斑蝥黄顺反异构体色谱峰面积(响应值)总和为纵坐标(y)，绘制标准曲线。测定结果显示，斑蝥黄在0.1～10.0 μg/mL的浓度范围内，其标准曲线方程为y=173 321x-9 521，相关系数(R2)为0.999 9，色谱图见图3。

图3 斑蝥黄标准溶液(1.0 μg/mL)色谱图

2.2 方法的检出限与定量限

向空白鸡蛋中添加斑蝥黄使之浓度为0.1 μg/g，其信噪比(S/N)大于10，并且经前处理后其浓度在线性范围内，该方法的检出限则根据S/N=3，确定的检出限可达到0.05 μg/g。所以最终确定方法的定量限为0.1 μg/g(图4)，检出限为0.05 μg/g，满足分析方法性能的要求。

图4 空白蛋黄添加斑蝥黄(0.1 μg/g)色谱图

2.3 样品的前处理方法优化

考虑到蛋黄中含有大量脂类物质，本试验开展了针对乙腈提取液的正己烷分次萃取除脂研究，同时考察了乙腈-乙酸乙酯、无水乙醇-二氯甲烷2个不同混合溶剂提取体系对蛋黄中斑蝥黄的提取效率(与乙腈提取体系对比)。乙腈由正己烷脱脂和乙腈-乙酸乙酯、乙腈和无水乙醇-二氯甲烷3种提取溶剂提取再经固相萃取柱净化后的回收率结果见图5。

图5 不同前处理对斑蝥黄回收率的影响

2.4 方法的准确度与精密度

在确定最佳提取体系后，计算斑蝥黄在不同加标浓度下的回收率及相对标准偏差，结果见表1。在加标浓度为0.1～4.0 μg/g的浓度范围内，斑蝥黄回收率为85.9%～98.6%，相对标准偏差(RSD)为1.7%～8.0%。

表1 斑蝥黄回收率试验结果

2.5 其他色素干扰性试验

常用的着色剂如叶黄素、β-阿朴-8′-胡萝卜素醛、β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯，常被饲料生产商和养殖场添加至饲粮中，为了验证该方法能够很好地测定出蛋黄中斑蝥黄的含量，而不被其他色素所干扰，本试验考察了虾青素、玉米黄质、叶黄素、斑蝥黄、β-阿朴-8′-胡萝卜素醛、β-阿朴-8′-胡萝卜素酸乙酯混合标准溶液的色谱分离情况，图6显示，在保留时间在11.7 min左右，没有除斑蝥黄以外的干扰峰。

2.6 检测方法的应用

对所采购的白鸡蛋、红鸡蛋、五谷蛋和土鸡蛋采用1.4.1试验步骤进行前处理并经过高效液相色谱仪分析其斑蝥黄含量，结果见表2。

表2 市售不同类型鸡蛋斑蝥黄含量测定结果

2.7 定性与定量

斑蝥黄的顺反异构体紫外-可见吸收光谱图如图7所示：全反式斑蝥黄的最大吸收波长为474 nm左右，而顺式斑蝥黄的最大吸收波长为464 nm左右，除此之外，其在364 nm处还有1个明显的肩峰。

图7 全反式斑蝥黄(A)和顺式斑蝥黄(B)紫外-可见吸收光谱图

3 讨 论

3.1 前处理条件的选择

通过比较针对乙腈提取液的2种脱脂方法——正己烷分次萃取除脂和固相萃取柱净化，以及乙腈、乙腈-乙酸乙酯、无水乙醇-二氯甲烷3个不同溶剂提取体系对蛋黄中斑蝥黄的提取试验发现：乙腈对蛋黄中的斑蝥黄具有很好的提取效率，采用正己烷分次萃取除脂，虽然成本低，但是有机溶剂消耗量大，正己烷在萃取除脂的过程中造成了部分斑蝥黄损失，导致斑蝥黄回收率偏低，平均回收率不到80%(如图5所示)；乙腈-乙酸乙酯和无水乙醇-二氯甲烷提取液中基质在固相萃取柱上形成较强吸附，明显降低了斑蝥黄的回收率，二者的平均回收率分别为37.1%和45.5%(如图5所示)。此外，斑蝥黄提取过程中未净化完全的基质在色谱柱不能被完全洗脱，造成了色谱柱柱效降低，也使得仪器系统压力升高。

斑蝥黄具有脂溶性，并具有很强的疏水性，而PRiME HLB作为反相固相萃取吸附剂，对斑蝥黄具有很好的保留。整个净化过程无需要活化和平衡，在常压下实现了样品的净化。文献报道的将斑蝥黄提取液经过C18-SPE、硅胶-SPE、氰丙基-SPE以及中性氧化铝-SPE等固相萃取柱净化，大都采用复杂的活化、平衡步骤，在真空泵下操作；乙腈作为斑蝥黄的提取溶剂，与水混匀后，直接过固相萃取柱，无需浓缩至干，避免了加热可能造成的斑蝥黄分解。

因此，本试验选用乙腈超声提取蛋黄中斑蝥黄，取部分提取液与水混合后直接通过PRiME HLB固相萃取柱净化。

3.2 方法学考察

斑蝥黄在0.1～10 μg/mL的浓度范围内呈现良好线性关系良好，相关系数大于0.999；蛋黄中斑蝥黄的检出限为0.05 μg/g，定量限为0.1 μg/g，说明该方法具有较好的灵敏度；在低、中、高3个加标浓度下，斑蝥黄的平均回收率大于85%，相对标准偏差小于10%，说明该方法具有较高的准确性和精密度；常见色素色谱峰对斑蝥黄的顺反异构体色谱峰没有产生干扰，表明该方法专一性好；通过应用发现，该方法适用于对市场上新鲜商品鸡蛋蛋黄中斑蝥黄的快速、准确检测。

3.3 斑蝥黄的定性与定量

在对斑蝥黄定量时统计的是2种异构体的总量[2]。斑蝥黄标准品主要成分为全反式异构体，含量达95%以上，其次还有部分顺式异构体。而对鸡蛋黄中斑蝥黄分析过程中发现，斑蝥黄顺式异构体约占15%。

4 结 论

① 本试验采用乙腈在超声波辅助下成功提取了蛋黄中的斑蝥黄，斑蝥黄乙腈提取液用水稀释后直接过PRiME HLB固相萃取柱，以乙腈和水的混合溶液洗脱，乙腈淋洗，即可完成样品的前处理。

② 蛋黄中斑蝥黄的检出限为0.05 μg/g，定量限为0.1 μg/g。斑蝥黄在0.1～10.0 μg/mL的浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.999。在3个加标浓度(0.1、1.0和4.0 μg/g)下，斑蝥黄的回收率为85.9%～98.6%，相对标准偏差为1.2%～8.0%。

③ 应用上述乙腈提取+固相萃取-反相高效液相色谱法对市场上新鲜商品鸡蛋蛋黄中斑蝥黄进行检测，结果显示所选购市售鸡蛋蛋黄中斑蝥黄含量差异较大，从低于0.1 μg/g到高达8.3 μg/g不等。

④ 综上可知，本试验建立的固相萃取-反相高效液相色谱法测定蛋黄中斑蝥黄的方法可应用于对新鲜商品鸡蛋蛋黄中斑蝥黄的快速、准确定量。