高效液相色谱同步检测饲料中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮及呕吐毒素的方法

刘 颖 金永鹏 罗荪琳 陈义强

(中国农业大学动物科技学院，动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

全球范围内，每年约有25%的谷物受到霉菌毒素污染，给畜牧业造成了巨大的经济损失[1]。目前已发现的霉菌毒素有200多种，其中黄曲霉毒素(aflatoxins，AFs)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)及呕吐毒素(deoxynivalenol，DON)是饲料中最常见的3类霉菌毒素[2]。黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，常见的有黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)，其中以AFB1毒性最强，具有致癌性[3]。ZEA主要由镰刀菌产生，具有高毒性，广泛存在于玉米、小麦等饲料原料中，是一种雌激素类似物，可导致畜禽性激素机能紊乱，还具有一定程度的肝脏毒性、遗传毒性及免疫毒性[4-5]。DON又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，是由镰刀菌属产生的低分子质量次级代谢产物，可导致畜禽胃肠功能紊乱、皮肤黏膜损伤及免疫性能低下[6-7]。

我国《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)[8]中规定了霉菌毒素的限量，如AFB1在玉米加工产品中的限量为≤50 μg/kg，在仔猪配合饲料中的限量为≤10 μg/kg；ZEA在玉米等饲料原料中的限量为≤0.5 mg/kg；DON在植物性饲料原料中的限量为≤5 mg/kg，在猪配合饲料中的限量为≤1 mg/kg。建立饲料中霉菌毒素的检测方法对于筛选合格饲料、保障畜禽机体健康及畜禽产品安全具有重要的意义。目前，霉菌毒素的检测方法主要有薄层色谱法[9-11]、免疫层析法[12-13]、酶联免疫吸附法[14-16]、高效液相色谱(HPLC)法[17-19]以及液相色谱-串联质谱法[20-22]，其中薄层色谱法、免疫层析法和酶联免疫吸附法主要用于霉菌毒素的快速筛检，而HPLC法和液相色谱-串联质谱法则主要用于霉菌毒素的定量分析。HPLC法对仪器设备要求低，但通常只能用于单种霉菌毒素的检测；液相色谱-串联质谱法可用于多种霉菌毒素的同步检测，但仪器设备昂贵且维护成本高，不适于基层实验室对霉菌毒素的定量分析。目前可同步检测多种霉菌毒素的HPLC法相关文献报道较少。因此，本试验旨在建立一种对饲料中AFB1、ZEA及DON含量同步检测的HPLC法，为基层实验室中饲料霉菌毒素的快速定量检测提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

甲醇、乙腈，色谱纯，德国Merck公司；AFB1、ZEA、DON标准品溶液(1 mg/mL)，美国Sigma公司；吐温-20(tween-20)，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾，分析纯，北京化工厂有限责任公司，用于配制pH 7.0的磷酸盐缓冲液(PBS，称取8.0 g氯化钠、1.44 g磷酸氢二钠、0.24 g磷酸二氢钾、0.2 g氯化钾，用990 mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH至7.0，最后用纯水稀释至1 000 mL)。

1.2 色谱条件

色谱柱：SymmetryShield RP18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)。流动相组成为水/甲醇，荧光检测器激发波长为360 nm，发射波长为440 nm，紫外检测器设置双波长为218 nm/265 nm。柱温30 ℃，进样量40 μL，流速0.8 mL/min，洗脱时间为20 min，洗脱程序为：有机相(甲醇)在0～7 min时质量分数为30%，7～8 min时质量分数由30%变为75%并保持至第15 min，15～16 min时质量分数由75%变为30%并保持至第20 min。

1.3 标准溶液配制

本实验室购买的AFB1、ZEA、DON标准品溶液浓度均为1 mg/mL。准确移取一定体积的AFB1、ZEA、DON标准品溶液，用50%甲醇-水稀释，最终配成AFB1浓度分别为1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL，ZEA浓度分别为50、125、250、500、1 000、2 500 ng/mL，DON浓度分别为100、250、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的三合一霉菌毒素标准工作溶液。在所设定的液相色谱条件下，按照低浓度至高浓度进行进样，采用外标法定量，作峰面积-浓度标准曲线，得到3种霉菌毒素的标准曲线回归方程。

1.4 样品处理方法

准确称取试样2.0 g于50 mL离心管中，准确加入20 mL乙腈-水(体积比6∶4)溶液，振荡30 min，以6 010×g高速离心10 min。准确移取2.0 mL上清液并加入28.0 mL含1%吐温-20的PBS(pH 7.0)稀释，备用。将上述30 mL滤液以1～2滴/s的流速全部通过ADZ三合一免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱。将10 mL纯水以1～2滴/s的流速通过亲和柱，直至空气进入亲和柱。将2 mL色谱级甲醇以1滴/s的流速淋洗亲和柱，将淋洗液收集于玻璃试管中。50 ℃下浓缩氮气吹干后，用50%甲醇-水定容至0.5 mL，供HPLC分析。

1.5 结果计算

按照以下公式计算饲料样品中各种霉菌毒素的含量：

X=[(c/f)×v]/m。

式中：X为试样中霉菌毒素(AFB1、ZEA、DON)的含量(μg/kg)；c为由标准曲线得到试液中霉菌毒素的浓度(ng/mL)；v为饲料样品加入乙腈-水定容体积(mL)；f为浓缩倍数；m为所称取的样品质量(g)。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制备

按选定的色谱条件对已配制的三合一霉菌毒素标准工作溶液进行上样检测，以各霉菌毒素标准品溶液浓度为横坐标(X，ng/mL)，色谱峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。由表1可知，AFB1标准品溶液浓度在2.5～50.0 ng/mL、ZEA标准品溶液浓度在50～2 500 ng/mL、DON标准品溶液浓度在250～5 000 ng/mL时线性关系良好，相关系数均大于0.99。

表1 3种霉菌毒素的线性范围、回归方程及相关系数

图1 空白溶剂和AFB1标准溶液色谱图

2.2 添加回收试验和稳定性试验

称取空白肉鸡饲料做回收试验，每种霉菌毒素设置3个添加浓度，每个添加浓度进行3次平行测定，按1.4方法进行处理，上样检测，测定的3种霉菌毒素回收率见表2。由表可知，用所建HPLC法进行霉菌毒素的添加回收试验，3种霉菌毒素均可达到较稳定的回收率，在81.2%～92.3%，相对标准偏差(RSD)在4.3%～9.5%。

表2 3种霉菌毒素的回收率

图2 空白溶剂和ZEA标准溶液色谱图

图3 空白溶剂和DON标准溶液色谱图

为了进一步验证所建HPLC法对不同饲料样品的适用性以及同一样品标准溶液在不同时间段测定结果的稳定性，称取空白玉米原料、小麦原料及猪配合饲料，参照我国《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)[8]的限定值添加霉菌毒素，3种空白饲料加标样品中AFB1、ZEA、DON标准溶液的添加浓度分别为20、500和3 000 μg/kg，按1.4方法进行处理，每间隔2 h进行上样检测，共检测9次，不同加标样品溶液中AFB1、ZEA和DON含量随时间变化结果见图4至图6，在玉米原料、小麦原料及猪配合饲料加标样品溶液中，不同时间段AFB1、ZEA和DON检测值间的RSD均小于9.0%。

图4 不同加标样品溶液中AFB1检测含量随时间的变化

图5 不同加标样品溶液中ZEA检测含量随时间的变化

图6 不同加标样品溶液中DON检测含量随时间的变化

2.3 饲料样品的检测

采集送检肉鸭配合饲料、玉米芯粉、玉米、小麦饲料样品共计41份，采用所建HPLC法检测每份饲料样品中的AFB1、ZEA及DON总含量。由表3可知，所有饲料样品均检测出1种以上霉菌毒素，肉鸭配合饲料中AFB1检出率100%，超标率达81.8%；玉米芯粉中ZEA含量严重超标，检出率及超标率均达100.0%；4种饲料样品中DON含量未有超标，检出率为27.3%～100.0%。

表3 4种饲料样品中霉菌毒素的检测含量

3 讨 论

3.1 色谱条件的选择与优化

试验首先针对色谱条件的选择与优化2个方面进行了重点研究。对于霉菌毒素检测波长的选择，不同文献报道的不尽相同。Gell等[23]在激发波长365 nm，发射波长455 nm色谱荧光检测条件下定量检测真菌培养物中的AFB1含量，取得良好效果；Kim等[24]所建立的同时检测黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)和赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)含量的HPLC法，可准确用于动物饲料中霉菌毒素定量分析，其中黄曲霉毒素荧光检测条件为激发波长360 nm，发射波长450 nm。班晓敏[25]和何苗等[26]的试验均采用218 nm紫外检测波长检测饲料中DON含量，具有较高的准确度。而ZEA既可通过荧光检测器进行测定，对于紫外检测器也有较好的响应效果，其检测波长不同报道有所差异[27-29]。参照前人研究文献及免疫亲和柱产品说明书，以霉菌毒素峰形和分离效果为指标，本研究对检测波长进行了筛选优化，最终采用荧光检测器-柱后衍生的方法在激发波长、发射波长分别为360、440 nm时对AFB1含量进行检测，采用紫外检测器在检测波长分别为265、218 nm时分别对ZEA和DON含量进行检测。

对于流动相的选择，液相色谱检测多以乙腈与水或甲醇与水体系为主[30-31]。本研究通过对AFB1、ZEA、DON单标采用这2种流动相体系进行上样分析，结果发现：甲醇与水流动相体系下，霉菌毒素峰对称性好、分离效果最佳，故将其作为同步检测3种霉菌毒素的流动相体系。通过对AFB1、ZEA、DON标准溶液在不同比例的甲醇∶水(1∶1、2∶8、3∶7、4∶6)条件下进样分析，发现DON最早出峰，且当甲醇:水比例为3∶7时，DON峰形最佳，故洗脱程序起始设置为30%有机相保持7 min使DON得以洗脱出来。通过数次更换不同时间段的流动相比例及洗脱时间对三合一霉菌毒素标准品进行上样分析，观察出峰时间、峰面积及分离效果，以优化洗脱程序，最终确定了1.2色谱条件中所述的洗脱程序。该洗脱程序洗脱时间仅为20 min，可同步检测饲料中AFB1、ZEA及DON含量，而研究表明，这3种霉菌毒素单独检测时其上样分析时间均在10 min以上[26，32-33]。因此，本研究所建方法检测时长相对较短，可大大提高检测效率。

3.2 回收率和精密度

添加回收试验是验证霉菌毒素检测方法的重要组成部分，对于同步检测多种霉菌毒素含量的液相色谱方法研究，因前处理方法、所检测霉菌毒素种类以及样品种类等的不同，其加标回收率和精密度也显示出较大差异。Irakli等[34]建立了同步检测麦麸中黄曲霉毒素、ZEA、DON及OTA的HPLC法，其中ZEA和DON的平均回收率为84.5%～100.8%，而AFB1的平均回收率则不太稳定，为70.3%～101.4%，RSD为2.7%～12.0%。在李克等[35]的研究中，加标玉米样品ZEA和OTA的回收率为83.1%～91.9%，RSD为3.1%～9.3%，该方法可用于准确检测玉米、小麦和稻米中ZEA和OTA含量。Chen等[28]所建立的同步检测花生中霉菌毒素HPLC法，6霉菌种毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、ZEA和OTA)均具有良好的加标回收率，为83.1%～99.3%，且RSD均小于10.0%，精密度较好，但该方法部分毒素的保留时间较为接近，实际样品检测时分离效果可能不太理想。本研究添加回收试验结果显示，加标空白肉鸡饲料样品中，不同添加浓度的AFB1、ZEA及DON的平均回收率为81.2%～92.3%，RSD为4.3%～9.5%，这说明本研究所建HPLC法具有较高的准确度与精密度。此外，本研究还考察了不同加标样品溶液中霉菌毒素检测含量随时间变化情况，结果显示，AFB1、ZEA及DON检测值在不同加标样品溶液中随时间波动不大，相对标准偏差均小于9.0%，这表明该方法具有较强的稳定性，可实际应用于基层实验室不同饲料品种中霉菌毒素的定量检测，有利于保障饲料质量安全。

3.3 饲料样品的检测

饲料原料在生产、贮存、运输等过程中，受气候、季节、加工不当等因素影响，极易发生霉变而产生霉菌毒素[36]。玉米、小麦是世界上产量最大的粮食作物，在我国作为饲料原料被大量用于畜禽配合饲料中。在本试验所检测的8份玉米样品中，AFB1检出率高达100%，ZEA和DON检出率为50%；而16份小麦样品均检出ZEA和DON，说明这2类饲料原料易受霉菌毒素污染，且霉菌毒素共存现象较为普遍，这与龚阿琼等[37]和史海涛等[38]研究结果相一致。在玉米芯粉样品中，ZEA含量严重超标，最高含量达3 676.8 μg/kg，远高于《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)[8]限定值1 000 μg/kg，畜禽采食后可能会造成严重的器官损伤、免疫抑制，甚至引起畜禽死亡。配合饲料中的霉菌毒素污染问题同样严峻，研究表明，AFB1、ZEA、DON等毒素在部分猪全价料、肉鸡配合饲料以及宠物饲料中有着极高的检出率及超标率[39-41]。本次所检11份肉鸭配合饲料中，AFB1和ZEA检出率均达100%，其中AFB1超标率达81.8%，生产中此类高AFB1含量的饲料极易引发畜禽急性中毒现象，危害畜禽机体健康。

此外，霉菌毒素间的协同效应同样不容忽视。Levkut等[42]报道，ZEA、DON混合毒素能严重抑制肉鸡白细胞的吞噬能力，降低肉鸡免疫力。杨云斌[43]研究表明，ZEA与AFB1联合添加能显著降低人肝癌HepG2细胞活力，诱导细胞凋亡，两者表现为协同效应。Sun等[44]试验发现，AFB1与DON协同作用会加剧大鼠肝脏细胞毒性。本试验所检小麦样品，其ZEA、DON含量虽均未超标，但最高含量分别达到了987.5和4 876.9 μg/kg，接近《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)[8]限定值，且2种毒素存在协同增效可能，若畜禽长期采食，易降低机体免疫力，增加疾病易感性。从以上检测结果可以看出，常见植物性饲料原料以及配合饲料中的AFB1、ZEA及DON污染问题不容乐观。因此，在生产和养殖过程中，应严格把控饲料生产加工、存储、运输等环节，减少饲料霉菌毒素污染；同时，做好饲料原料及配合饲料的霉菌毒素检测工作，最大程度地避免畜禽采食霉变饲料，保障畜禽机体健康。

4 结 论

本研究所建立的HPLC法能够同步检测饲料样品中的AFB1、ZEA及DON含量。该方法准确度和精密度高，稳定性好，样品前处理操作简单，检测时间较短，能大大提高生产中霉菌毒素检测效率。采用该方法实际检测了4种饲料样品中AFB1、ZEA及DON含量，说明该方法适用性强，可用于不同饲料样品的霉菌毒素检测，作为饲料中常见霉菌毒素含量的检测分析方法。