溶血性葡萄球菌来源的细胞外囊泡对小鼠生长性能、免疫力、肠道形态与微生物区系的影响

罗梅英 凌铭旺 詹洲玲 郑将鸿 钟晓彤 欧春秀 梁樱倩 冯 鑫 王瑞晓 黄得纯 张辉华 柒启恩,2*

(1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，佛山 528231；2.华南农业大学，广东省动物营养调控重点实验室，广州 510642)

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是细胞分泌至胞外的膜性囊泡[1]。近年来，关于它作为细胞间新“细胞信使”的研究越来越多，且受到广泛的重视[2-3]。在各种原核和真核微生物中，许多细胞因子与EVs有关，EVs运输是一种普遍现象[3-4]。EVs由真核生物、古细菌和细菌产生，由脂质双分子层组成，形成直径从20～500 nm不等的含腔球体[5]。研究显示，EVs参与肿瘤进展、免疫调节、新陈代谢、肠道微生物区系的塑造等过程[6-10]。细菌来源的EVs于1965年首次在大肠杆菌中被发现[11]。细菌来源的EVs携带多种物质，包括毒力因子、黏附素、DNA、RNA、毒素、免疫调节因子和营养清除因子，与细胞毒性、宿主细胞入侵、膜融合、生物膜的产生、病毒入侵、DNA传递、受体响应和抗生素耐药蛋白的转移过程相关[12-13]。

葡萄球菌是一种圆形或卵圆形的革兰氏阳性球菌，呈葡萄状，无鞭毛，无荚膜，不产生芽孢[14]。临床上，葡萄球菌病主要是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)引起的。金黄色葡萄球菌是一种常见的人兽共患病原菌，在自然界分布广泛，可引起人和动物感染，也可引起细菌性食物中毒或饲料中毒[15]，肠毒素是导致金黄色葡萄球菌食物中毒的主要毒力因子[16]。相比金黄色葡萄球菌，关于溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)的研究鲜有报道。溶血性葡萄球菌是一种凝固酶阴性葡萄球菌，以共生菌的形式存在于皮肤中[17]，是重要的医院感染病原菌[18]。酚可溶性调节肽(phenol-soluble modulins,PSM)是溶血性葡萄球菌的主要毒力因子，是一类具有广泛的细胞溶解活性的两亲性肽毒素，包含一种α型PSM和3种β型PSM，4种PSM均具有较强的促炎活性，可促进中性粒细胞趋化[19]。溶血性葡萄球菌来源的细胞外囊泡(SH-EVs)是否携带PSM，是否通过PSM产生促炎活性尚不明确。本试验拟研究SH-EVs对小鼠生长、免疫功能、肠道结构及微生物区系的影响，以期为细菌EVs的深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株及其培养

溶血性葡萄球菌为本实验室保存菌种，由生工生物工程(上海)股份有限公司通过16S rRNA基因测序进行菌种鉴定，采用YPD液体培养基(含1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、2.0%葡萄糖)于30 ℃下在转速为200 r/min的水平摇床上振荡培养14～16 h至OD600 nm达到1.0～1.5。

1.2 SH-EVs的分离、纯化与鉴定

将保存的溶血性葡萄球菌菌种复苏，在新鲜LB液体培养基中于30 ℃下在转速为200 r/min的水平摇床上扩大培养，使OD600 nm达到1.0～1.5；然后将培养物于4 ℃、2 000×g离心10 min；收集上清于4 ℃、10 000×g离心30 min；取上清经过超速离心机于4 ℃、120 000×g离心90 min，得到SH-EVs沉淀，将获得SH-EVs沉淀经过磷酸盐缓冲液(PBS)重悬后再一次经超速离心机于4℃、120 000×g离心90 min，富集得到的沉淀即为纯化的SH-EVs，纯化后的SH-EVs用PBS重悬，放入-80 ℃保存备用。

将10 μL SH-EVs的PBS悬液滴加于铜网上沉淀20 min，用滤纸吸去浮液，接着再用蒸馏水漂洗1～3次。吸取2%的醋酸双氧铀10 μL滴加于铜网上沉淀1 min，滤纸吸去浮液后常温干燥15 min，通过JEM-2000EX透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)来观察SH-EVs的外部形态特征[20]。利用纳米颗粒跟踪分析仪(Zetasizer Nano ZS)来测定EVs的粒径[21]。利用二奎啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测定SH-EVs的蛋白质浓度。

1.3 试验动物及饲养管理

试验动物为无特定病原体(SPF)级的健康雄性C57BL/6小鼠，14～17 g，28～30日龄，购自广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2018-0002。饲养环境温度保持在(22±2)℃，相对湿度保持在(50±10)%，光照周期为12 h光照/12 h黑暗。动物试验开始前先使小鼠习惯动物设施1周，动物试验按照《实验动物管理条例》(2017年修订)执行。

1.4 试验设计

选取20只小鼠，采用完全随机试验设计分为2个组，每组10个重复，每个重复1只小鼠。参照Teng等[9]的方法，每隔1 d给试验组小鼠灌服150 μL SH-EVs悬液(含500 μg SH-EVs)，给对照组小鼠灌服150 μL PBS，共灌服3次。试验期为5 d。试验期内自由饮水、自由采食。试验饲粮为购自广东省医学实验动物中心的小鼠标准饲粮。

1.5 样品采集

1.5.1 小鼠生长性能数据采集

在试验始末清晨对每只小鼠进行空腹称重，记录个体重；试验过程中记录每只小鼠每天的采食量。

1.5.2 小鼠粪便采集

试验结束当天采集小鼠的新鲜粪样，置于2 mL无菌PE管中，于-80 ℃条件下储存待测。

1.5.3 小鼠血液采集

试验结束后利用蘸有异氟烷的棉球将小鼠麻醉，然后对小鼠进行眼球采血，血液静置1 h后，3 000 r/min离心20 min，分离血清。小心吸取血清分装于1.5 mL的试管中，于-80 ℃条件下储存待测。

1.5.4 小鼠回肠组织采集

采血后，断颈处死小鼠，剖开腹腔，于回肠中段采集2 cm左右的组织样品，灭菌生理盐水冲洗干净，置于4%甲醛缓冲溶液中固定，以备制作切片。

1.6 检测指标与方法

1.6.1 小鼠生长性能指标测定

根据试验始末小鼠体重计算平均日增重(ADG)；根据每只小鼠每日的采食量计算平均日采食量(ADFI)；根据平均日增重及平均日采食量计算料重比(F/G)。

1.6.2 小鼠血清免疫指标测定

血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)含量均采用上海酶联生物科技有限公司生产的试剂盒测定，测定方法按照说明书进行。

1.6.3 小鼠肠道形态观察

将固定的回肠标本经脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、展片、常规苏木精-伊红(HE)染色等处理后，制成石蜡切片。之后用显微镜在40倍下随机选择多个非连续性视野观察切片，并挑选典型视野拍摄成图片。

1.6.4 小鼠肠道微生物区系测定

从小鼠粪便样本中提取基因组DNA后，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。用带有barcode的特异引物扩增16S rDNA的V3+V4区，引物序列为:341F，5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；806R，5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′。然后PCR扩增产物切胶回收，用QuantiFluorTM荧光计进行定量。将纯化的扩增产物进行等量混合，连接测序接头，构建测序文库，使用HiSeq2500的PE250模式上机测序。

测序得到raw reads之后，对低质量reads进行过滤，再进行序列拼接、序列过滤、序列去嵌合体等处理，得到优化序列(tags)。用Uparse软件以97%的一致性(identity)对所有样品的优化序列聚类成为操作分类单元(OTU)，获得OTU后，根据分析流程，使用QIIME(version 1.9.1)依次进行OTU分析、Alpha多样性分析、菌群结构分析[22]。

1.7 数据处理

试验数据经Excel 2019初步整理后，采用SPSS 19.0统计软件的独立样本t检验法进行组间差异显著性比较，以P<0.05为差异显著，0.05≤P<0.10为差异有显著趋势，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 SH-EVs的生物学特性

采用差速离心法从溶血性葡萄球菌培养液上清中得到较多的纯化SH-EVs(图1-a)。对纯化SH-EVs进行TEM观察(图1-b)，发现SH-EVs大小不一，外形呈现圆形或椭圆形，直径100 nm左右，在20～500 nm范围之内，符合细菌EVs颗粒粒径的要求。随后采用纳米颗粒跟踪分析仪检测纯化SH-EVs的粒径分布(图1-c)，结果显示模式曲线线条平缓流畅，说明含有的杂质较少，纯度较好；检测得到的粒子分布系数(PDI)为0.271，介于0.08～0.70，证明体系分散度适中，检测结果置信度高；平均粒径为122.5 nm，粒径主峰为162.3 nm，粒径20～200 nm百分比为69.9%，与细菌EVs的理论颗粒粒径大小基本吻合。

a：分离纯化SH-EVs的主要步骤示意图；b：TEM观察SH-EVs的形态；c：Zetasizer Nano ZS检测SH-EVs的粒径分布。

2.2 SH-EVs对小鼠生长性能的影响

由表1可知，与对照组相比，小鼠灌服SH-EVs显著降低了平均日采食量和平均日增重(P<0.05)，有提高料重比的趋势(P=0.052)，其中平均日采食量降低了4.80%，平均日增重降低了12.87%，料重比提高了9.20%。

表1 SH-EVs对小鼠生长性能的影响

2.3 SH-EVs对小鼠血清免疫指标的影响

由表2可知，与对照组相比，小鼠灌服SH-EVs显著提高了血清TNF-α和IL-10含量(P<0.05)，显著降低了血清IgA含量(P<0.05)，有降低血清IgG含量的趋势(P=0.067)，其中TNF-α和IL-10含量分别提高了16.26%和4.54%，IgA和IgG含量分别降低了9.15%和6.03%。

表2 SH-EVs对小鼠血清免疫指标的影响

2.4 SH-EVs对小鼠肠道形态的影响

由图2可知，对照组小鼠的回肠绒毛生长状态良好，完整性好，数量较多，密度较大；而试验组小鼠的回肠绒毛密度降低，有一定程度的损伤。

PBS代表对照组，SH-EVs代表试验组。下图同。PBS represented control group and SH-EVs represented test group.The same as below.

2.5 SH-EVs对小鼠肠道微生物区系的影响

2.5.1 Alpha多样性分析

目前，我国科技馆建设还处于发展阶段，属于一个发展壮大且没有前人可以借鉴的行业，建立科技馆行业自有的职称评聘体系，对科技馆行业是一大幸事，有利于科技馆从业者的职业规划和未来发展，同时也能有效刺激科技馆专业技术人才的素质发展和能力提升。目前科技馆的职称评定工作还在探索尝试中，存在许多现实问题，需要提升和改善的地方还有很多，如何尽快设立合法、合理、科学自有职称序列，我们科技馆人任重道远。

由表2可知，对照组和试验组检测到的物种数量均较高，在1 934～2 010个；覆盖度也均在99.6%以上，说明测序结果已基本覆盖样本的多样性。对照组和试验组的Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数均差异不显著(P>0.05)。

2.5.2 稀释曲线

通过绘制稀释曲线可评价测序量是否足够，并能间接反映样本中物种的丰富程度。由图3-a可见，各样本的稀释曲线趋于平缓或者达到平台期，可以认为继续增加测序深度已经不影响物种多样性，说明测序量足够。

2.5.3 韦恩图

韦恩图可用于统计多个样本中所独有与共有的OTU数目，能够比较直观地表现样本的OTU数目组成相似性及重叠情况。由图3-b可知，对照组和试验组共有1 740个OTU，对照组独有1 355个OTU，试验组独有1 168个OTU。

2.5.4 基于OTU的主成分分析(PCA)

通过分析不同样本OTU(97%相似性)组成能够反映样本之间的差异和距离，PCA运用方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴取能够最大反映方差值的2个特征值。由图3-c可知，对照组与试验组样本分散较远，相似性有较大差异。

表3 Alpha多样性指数

图3 稀释曲线(a)、韦恩图(b)和PCA图(c)

2.5.5 小鼠肠道菌群结构

灌服SH-EVs对小鼠肠道菌群门水平相对丰度的影响如图4所示。从样本中获得的主要菌群分别属于拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)，在对照组中分别占42.84%和13.19%，在试验组中分别占23.56%和16.99%(图4-a)。与对照组相比，灌服SH-EVs显著降低了小鼠肠道Bacteroidetes的相对丰度(P<0.05)，显著提高了酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)的相对丰度(P<0.05)(图4-b)。

Bacteroidetes：拟杆菌门；Firmicutes：厚壁菌门；Acidobacteria：酸杆菌门；Actinobacteria：放线菌门；Chloroflexi：绿弯菌门；Proteobacteria：变形菌门；Planctomycetes：浮霉菌门；Verrucomicrobia：疣微菌门；Gemmatimonadetes：芽单胞菌门；Other：其他。

灌服SH-EVs对小鼠肠道菌群属水平相对丰度的影响如图5所示。从样本中获得的主要菌群分别属于阿里叶柄菌属(Alistipes)、毛螺菌科NK4A136组(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、螺杆菌属(Helicobacter)，在对照组中分别占4.44%、3.79%、3.07%，在试验组中分别占6.05%、3.48%、3.70%(图5-a)。与对照组相比，灌服SH-EVs显著降低了小鼠肠道普雷沃氏菌科UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)、拟杆菌属(Bacteroides)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)的相对丰度(P<0.05)(图5-b)。

Alistipes：阿里叶柄菌属；Lachnospiraceae_NK4A136_group：毛螺菌科NK4A136组；Helicobacter：螺杆菌属；Acidothermus：热酸菌属；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃氏菌科UCG-001；Bacteroides：拟杆菌属；Alloprevotella：拟普雷沃菌属；Odoribacter：臭味杆菌属；Other：其他。

灌服SH-EVs对小鼠肠道菌群种水平相对丰度的影响如图6所示。从对照组样本中获得的主要菌群为产酸拟杆菌(Bacteroidesacidifaciens)、Helicobactermastomyrinus、马赛拟杆菌dnLKV3(BacteroidesmassiliensisdnLKV3)，分别占0.85%、0.77%、0.59%；从试验组样本中获得的主要菌群为毛螺菌科细菌28-4(Lachnospiraceae_bacterium_28-4)、BacteroidesmassiliensisdnLKV3、嗜酸细小链孢菌DSM44928(CatenulisporaacidiphilaDSM44928)，分别占0.73%、0.44%、0.43%(图6-a)。与对照组相比，灌服SH-EVs显著降低了小鼠肠道Bacteroidesacidifaciens的相对丰度(P<0.05)，显著提高了毛螺菌科细菌COE1(Lachnospiraceae_bacterium_COE1)的相对丰度(P<0.05)(图6-b)。

Bacteroides acidifaciens：产酸拟杆菌；Bacteroides massiliensis dnLKV3：马赛拟杆菌dnLKV3；Catenulispora acidiphila DSM44928：嗜酸细小链孢菌DSM44928；Lachnospiraceae_bacterium_28-4：毛螺菌科细菌28-4；Lachnospiraceae_bacterium_COE1：毛螺菌科细菌COE1；Pseudomonas geniculate：弯曲假单胞菌；Clostridiales_bacterium_CIEAF_020：梭菌目细菌CIEAF020；Brevibacillus formosus：美丽短芽胞杆菌；Other：其他。

3 讨 论

本试验采用TEM和Zetasizer Nano ZS从形态学和颗粒大小对SH-EVs进行了系统分析。结果显示，大部分SH-EVs粒径在20～500 nm，外形呈现圆形或椭圆形，符合文献报道的关于细菌EVs的形态特征[5]。

本试验研究了SH-EVs对小鼠生长性能、血清免疫指标的影响，结果显示小鼠灌服SH-EVs后平均日采食量和平均日增重以及血清IgA、IgG含量降低，血清TNF-α和IL-10含量升高。血清免疫球蛋白含量是反映动物机体免疫性能的重要指标之一，血清中IgA、IgG含量的降低表明动物体免疫机能减弱；TNF-α和IL-10参与炎性反应和免疫反应，是炎症因子[23-25]。溶血性葡萄球菌的典型毒力途径是：形成生物膜[26]，产生PSM[19]，由于大量的插入序列导致频繁的表型重排[27]。溶血性葡萄球菌感染主要由血液和器械相关感染引起，对免疫功能低下患者的影响尤为明显[28]。溶血性葡萄球菌产生的PSM具有较强的促炎活性[29]，引起发烧、发冷、心动过速和呼吸急促等症状。过激的免疫反应以败血症为特征[19]。溶血性葡萄球菌通过产生抑制剂作用于淋球菌细胞的生长和休眠[30]。炎症反应导致采食量减少，进而影响动物的生长[31]。本试验中，试验组小鼠生长性能的下降可能与灌喂SH-EVs引起的炎症反应有关。由此可见，SH-EVs的作用与其来源菌(溶血性葡萄球菌)较为相似，提示SH-EVs中可能含有来自于溶血性葡萄球菌的毒力因子PSM。

有些肠道炎症局限于结肠和直肠，有些则遍布全肠段[32]。小肠是吸收营养物质的主要场所[33]，小肠炎症直接影响到营养物质的吸收利用率。因此，本试验选择回肠作为观察点，研究SH-EVs对小鼠肠道形态的影响，结果显示，灌服SH-EVs后小鼠的回肠绒毛密度下降，出现一定程度的损伤。研究显示溶血性葡萄球菌的毒力因子PSM具有广泛的细胞溶解活性[19]。上述结果再次提示，SH-EVs中可能携带了来自于溶血性葡萄球菌的毒力因子PSM，PSM感染肠道上皮细胞，诱发了炎症反应和细胞损伤。

哺乳动物的肠道中有数万亿微生物，被视为是一个额外的器官。肠道微生物在维持肠道环境稳定和宿主健康方面起着重要作用[34-35]。肠道微生物在宿主免疫系统发育[36]、肠上皮细胞分化[35]、肠道黏膜屏障维持[37]中发挥了重要作用。肠道微生物的组成受多种环境因素的影响，包括抗生素、生活方式、饮食和卫生条件[35]。研究显示，动植物来源的EVs可改变动物肠道菌群结构[7-9]。本试验研究了SH-EVs对小鼠肠道菌群结构的影响，结果显示，从样本中获得的最主要菌门是Bacteroidetes，与文献报道[38]中关于小鼠肠道菌群的研究结果一致。在门水平上，灌服SH-EVs显著降低了小鼠肠道拟杆菌门的相对丰度，下降幅度高达52.25%，可见灌服SH-EVs对小鼠肠道菌群产生了较大的影响。在属水平上，灌服SH-EVs显著降低了小鼠肠道Prevotellaceae_UCG-001、Bacteroides、Alloprevotella的相对丰度，三者均属于Bacteroidetes，拟杆菌纲(Bacteroidia)，拟杆菌目(Bacteroidales)。发生这种变化主要可能是基于Bacteroidales的共同特征，而这种共同特征可能是SH-EVs的作用靶点。Bacteroidales的细菌可能通过摄取SH-EVs而摄入了PSM，进而诱发了细胞损伤。

SH-EVs含有哪些主要成分？是否携带了PSM，本研究没有直接的证据。引起小鼠炎症反应、免疫力下降、肠道菌群紊乱的物质基础及作用机制是什么？还需要更为深入地研究。

4 结 论

① 灌服SH-EVs降低了小鼠的平均日采食量和平均日增重，进而降低了小鼠的生长性能。

② 灌服SH-EVs提高了小鼠血清TNF-α和IL-10含量，降低了血清IgA含量，进而降低了小鼠的免疫力。

③ 灌服SH-EVs降低了小鼠回肠绒毛密度，损伤了回肠形态结构。

④ 灌服SH-EVs，在门水平降低了小鼠肠道Bacteroidetes的相对丰度，提高了Acidobacteria、Chloroflexi、Proteobacteria、Planctomycetes的相对丰度；在属水平降低了小鼠肠道Prevotellaceae_UCG-001、Bacteroides、Alloprevotella的相对丰度；在种水平降低了小鼠肠道Bacteroidesacidifaciens的相对丰度，提高了Lachnospiraceae_bacterium_COE1的相对丰度。