柠条锦鸡儿CkPHB基因调控木质部发育增强植物抗旱性的功能分析

李佳阳，谢丽芳，任洁洁，龚春梅*

(1 西北农林科技大学 生命科学学院，陕西杨陵 712100；2 西北农林科技大学 园艺学院，陕西杨陵 712100)

柠条锦鸡儿(Caraganakorshinskii)是豆科(Leguminosae)锦鸡儿属(Caragana)植物。广泛分布于中国西北荒漠及半荒漠地区的沙地，具有抗旱、抗寒、耐高温等多种优良性状，是一种兼具生态和经济效益的灌木[1-2]。干旱胁迫作为世界范围内影响作物产量的重要制约因素之一，极大地影响了植物的生长发育及分布区域[3-4]。干旱半干旱地区分布的植物经过长期适应，也表现出诸多抗旱特性。对柠条锦鸡儿的研究发现，Ckγ-ECS基因通过调节CkFAMA和CkSTOMAGEN基因的表达影响气孔密度提高植物的抗旱性[5]。同时，柠条锦鸡儿叶片中 C4光合酶表达量同样随着干旱程度的加剧而增加，逐步表现出向 C4特征的转变[6]。除此之外，在干旱胁迫下，柠条锦鸡儿CkWRKY家族成员CkWRKY2、CkWRKY4、CkWRKY75通过促进渗透调节物质的积累及抗氧化酶系统的表达增强了植物的抗旱性，其转基因植株叶片失水率、丙二醛含量均低于野生型，表现出更好的生存状态[7]。鉴于柠条锦鸡儿对保护生态环境、完成生态修复等方面具有的重要作用，以及应对干旱的多种抗逆特性，成为研究植物抗逆机制的理想材料。

目前与柠条锦鸡儿相关的研究主要集中在其生物学特性、生理变化以及解剖结构等方面，而柠条锦鸡儿在不同的干旱响应模式下，通过形成更发达的叶脉应对干旱胁迫的表型明显，但关注较少。拟南芥HD-ZIP Ⅲ家族成员PHB被认为参与了叶片近轴面特征的建立以及顶端分生组织的发育[8-9]。拟南芥中PHB和PHV基因功能获得型突变体phb-d和phv-d株系拟南芥以及玉米rld1突变体均产生了叶片黄化及上卷的表型[8, 10]。此外，叶原基从茎顶端分生组织向外生长的过程中，近轴端和远轴端的位置分别形成成熟叶片的上表面和下表面。phb-d和phv-d突变导致叶片远轴面向近轴面特征转变，受影响最严重的叶脉维管束表现出径向对称的方式发育，并在其周围表现出正面特征[11]。

本研究通过免疫组织化学染色对CkPHB蛋白在柠条锦鸡儿叶片中组织水平定位进行分析，后将CkPHB基因在拟南芥中过表达功能验证，通过荧光定量PCR的方法分析了转基因拟南芥中相关基因的表达量，同时对转基因拟南芥干旱处理表型进行观察，为丰富柠条锦鸡儿抗旱机制提供数据支撑。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本实验所用材料为西北农林科技大学实验场自然生长大约10年的柠条锦鸡儿，挑选健康饱满的柠条锦鸡儿种子用清水冲洗干净，湿纱布包裹后置于黑暗环境中室温萌发3～5 d，待种子萌发后移栽入盆。用于转化的野生型拟南芥为哥伦比亚型拟南芥(Col-0)，拟南芥种子置于无菌水中4 ℃避光春化2 d，经10%次氯酸钠清洗灭菌5 min，无菌水润洗6～8次，铺于相应的1/2 MS固体培养基上，正常培养5～7 d，后将拟南芥幼苗移栽入盆。

1.2 主要实验试剂

普通反转录酶MMLV(TaKaRa，2641A)，植物总RNA提取试剂盒(郑州贝贝生物科技有限公司，Cat# 082002)，去基因组cDNA反转录试剂盒(TaKaRa，RR047A)，荧光定量试剂盒(TaKaRa，RR820A)，高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa，R045B)，通用型DNA凝胶回收试剂盒(天根，DP209)、SP Rabbit HRP Kit(康为世纪，CW2035S)。

1.3 方 法

1.3.1 RNA提取及反转录选取生长适宜的植物叶片，具体步骤参照RNA提取试剂盒说明书进行提取。通过Nanodrop 2000测定RNA提取浓度，选用OD260/280为1.9～2.1且OD260/230>2的RNA。吸取1～2 μL RNA溶液与DNA上样缓冲液混匀，用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取质量，高质量RNA应为3条带，且28S RNA亮度约为18S RNA的2倍。

去基因组反转录(用于qRT-PCR)。吸取1 μg总RNA，加入基因组DNA清除溶液42 ℃反应2 min，去除RNA溶液中残余的基因组DNA干扰，之后参照说明书步骤将剩余试剂依次加入上一步反应溶液中，37 ℃反转录15 min，85 ℃反应5 s将反转录酶灭活，所得溶液即为cDNA溶液，使用时将cDNA溶液稀释3～5倍作为qRT-PCR的模板。

普通MMLV反转录单酶反转录(用于基因扩增)。MMLV单酶的反转录效率更高，适用于长链RNA反转。本实验使用时略作修改，将反转录RNA的总量由1 μg提升为3 μg，减少无酶水的体积，增加MMLV单酶的用量至1.5 μL，但不增加总反应体系，使cDNA浓度大大增加，有利于微量或复杂基因的克隆。

1.3.2 柠条锦鸡儿CkPHB全长cDNA克隆以普通MMLV反转录单酶反转录产物为模板，设计扩增引物CkPHB-F及CkPHB-R(表1)，使用高保真酶PrimeSTAR Max 按照56 ℃、58 ℃、60 ℃梯度退火扩增。具体反应扩增条件：98 ℃ 预变性2 min，98 ℃变性15 s，梯度退火10 s，72 ℃延伸20 s，72 ℃后延伸5 min，总计35个循环。

1.3.3 生物信息学分析通过pfam(http://pfam.xfam.org/)对其蛋白保守结构域进行分析；利用Mega[12-13]进行系统进化分析，算法采用邻接法，Bootstrap值设置为1 000。

1.3.4 CkPHB抗体制备及免疫组化分析通过人工合成CkPHB蛋白上具有免疫原性的肽段，对生长健康的新西兰大白兔进行皮下注射。经4次免疫后进行心脏采血，恒温静置收集血清即可作为CkPHB蛋白多克隆抗体使用。取柠条锦鸡儿叶脉石蜡切片脱蜡复水，经乙醇梯度复水至纯水后，将玻片浸入抗原修复液(A液：二水枸橼酸三钠29.41 g+蒸馏水1 000 mL；B液：枸橼酸21 g+蒸馏水1 000 mL；工作液：A液82 mL+B液18 mL+蒸馏水900 mL)中进行微波修复，待玻片自然冷却至室温，通过SP法进行免疫组化染色，之后通过DAB进行显色，明场下采集照片[14]。免疫组化所用部分试剂由SP Rabbit HRP Kit试剂盒提供，结合自制CkPHB一抗对柠条锦鸡儿叶片制备的石蜡切片中CkPHB蛋白的组织水平表达模式进行观测。

1.3.5 拟南芥转化及表型分析将确认无误的CkPHB表达载体转化农杆菌GV3101，28 ℃振荡培养过夜，离心收菌，用重悬液(5%蔗糖溶液、0.04%表面活性剂silwet)重悬至OD6000.6～1.0。采用蘸花法对拟南芥进行侵染[15]，将拟南芥未开放的花浸入侵染液中30～60 s，之后洗去残留的菌液，避光保湿培养12 h后改为正常培养。通过潮霉素对采集得到的种子进行筛选，转基因拟南芥能够正常生长，野生型拟南芥无法正常生长。

1.3.6 相关基因实时定量PCR利用Premier Primer 5.0设计相关基因的定量引物(表1)，反应体系参照说明书体系进行。实时定量PCR条件如下：95 ℃预变性30 s，然后95 ℃变性5 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，总计进行40个循环，然后进行熔解曲线分析，通过2-ΔΔCt的方法对相关基因的相对表达量进行计算[16]。每个样品设置3个生物学重复和3个技术重复。

表1 柠条锦鸡儿相关基因定量及克隆所用引物

1.3.7 生理指标测定丙二醛含量的测定。称取植物材料0.2～0.3 g(根据材料的受伤害程度)，剪碎，加入2 mL 10% TCA溶液和少量的石英砂研磨至匀浆。加入3 mL TCA溶液进一步研磨，匀浆转移至试管中，4 000 r/min离心15 min，取上清液2 mL加入2 mL TBA溶液将试管放入沸水浴中煮沸15 min(自试管内溶液中出现小气泡开始计时)，取出试管并冷却，再次离心取上清，测定450、532、600 nm的吸光度值[17]。

相对电导率的测定。取大小相当的植物叶片(尽量保证叶片的完整性，少含茎节)，用自来水冲洗后再用蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸净表面水分。避开主脉将叶片切割成大小一致的叶块，尽快称量0.1 g放入10 mL去离子水中不断抽气，直至叶片完全沉入水底处理3 h。用电导仪测定浸提液电导率(R1)，然后沸水浴加热30 min，冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导率(R2)，重复3次。相对电导率(%)=(R1/R2)×100%[18]。

脯氨酸含量的测定。每个样品均取0.2～0.3 g，分别置于大试管中，加入5 mL 3%磺基水杨酸溶液，于沸水浴中浸提10 min，冷却至室温，3 000 r/min离心10 min，取上清2 mL待测。同时配制脯氨酸标准曲线浓度梯度为0、1、2、4、6、8、10 μg/mL，各取2 mL，并加入2 mL冰醋酸、4 mL酸性茚三酮溶液和2 mL 3%磺基水杨酸溶液，摇匀，沸水浴加热显色1 h，冷却至室温，加入4 mL甲苯，充分振荡萃取红色产物，静置分层，取红色甲苯溶液520 nm处测吸光度[19]。

2 结果与分析

2.1 柠条锦鸡儿CkPHB基因克隆及保守结构域分析

以柠条锦鸡儿幼嫩叶片提取出来的RNA经MMLV单酶反转录得到的cDNA为模板，通过PrimeSTAR Max高保真酶设计温度梯度PCR扩增，得到了大小为1 200 bp左右的DNA片段(图1，A)。连接到TOPO载体后挑取阳性克隆(图1，B)鉴定。测序结果显示，实验克隆得到了CkPHB的编码序列共计1 170 bp。从NCBI获得拟南芥HD-ZIP Ⅲ家族成员ATHB8、AtPHV、AtPHB、AtREV及ATHB15的蛋白序列，与柠条锦鸡儿对应HD-ZIP Ⅲ家族成员蛋白序列一起通过pfam网站进行蛋白保守结构域分析(图2，A)。同时将柠条锦鸡儿与鹰嘴豆(Cicerarietinum)、毛果杨(Populustrichocarpa)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)等的PHB蛋白进行了系统发育分析(图2，B)。相比于其余成员，CkPHB蛋白结构出现了较大变化。

A.CkPHB基因克隆(M为marker；1-3. 3个温度梯度)；B.菌落PCR检测(M为marker；1-4. 不同单菌落检测结果)图1 柠条锦鸡儿CkPHB基因克隆A. CkPHB gene clone (M is marker; 1-3. 3 temperature gradients); B. Colony PCR detection (M is marker;1-4. Detection results of different single colonies)Fig.1 Cloning of CkPHB gene from C. korshinskii

A.柠条锦鸡儿HD-ZIP Ⅲ家族蛋白保守结构与分析；B.不同物种PHB蛋白系统发育分析；CaPHB. Cicer arietinum PHB；PtPHB. Populus trichocarpa PHB；AtPHB. Arabidopsis thaliana PHB；CkPHB. Caragana korshinskii PHB；GmPHB. Glycine max PHB；CcPHB. Cajanus cajan PHB图2 CkPHB蛋白结构及系统发育分析A. Conservative structure and analysis of HD-ZIP Ⅲ family proteins of C. korshinskii; B. Phylogenetic analysis of PHB proteins in different species; CaPHB. Cicer arietinum PHB; PtPHB. Populus trichocarpa PHB; AtPHB. Arabidopsis thaliana PHB; CkPHB. Caragana korshinskii PHB; GmPHB. Glycine max PHB; CcPHB. Cajanus cajan PHBFig.2 Structure and phylogenetic analysis of CkPHB protein

2.2 柠条锦鸡儿CkPHB功能验证及相关基因表达分析

通过人工合成CkPHB蛋白序列上具有免疫原性的小肽，制备柠条锦鸡儿CkPHB多克隆抗体。选取适宜大小的柠条锦鸡儿幼嫩叶片制备石蜡切片，脱蜡后经过一系列乙醇梯度复水及抗原修复处理，通过SP法对CkPHB蛋白的组织水平表达模式进行观察(图3)。结果表明，CkPHB蛋白特异定位于柠条锦鸡儿叶脉维管束木质部区域，为其调控木质部的发育提供了空间基础。为了验证其是否可以调控木质部的发育，把p35S∷CkPHB-GFP融合载体转化进农杆菌GV3101，鉴定无误后通过蘸花法侵染拟南芥，并经含有潮霉素的1/2 MS培养基筛选3代，最终获得了拟南芥CkPHB过表达株系(CkPHB-OE)T3代转基因植株3株。

A.实验组；B.对照组；xy. 木质部；标尺=50 μm图3 柠条锦鸡儿CkPHB蛋白定位于木质部导管周围A. Experiment; B. Control; xy. Xylem; Scale = 50 μmFig.3 The CkPHB protein of C. korshinskii is located around the xylem vessel

采集拟南芥野生型(WT)和CkPHB-OE株系的叶片，经过乙醇脱色及NaOH处理去除叶肉后，通过番红对拟南芥叶脉进行染色观察(图4)。相较于野生型拟南芥，拟南芥CkPHB-OE株系叶脉更为发达。除此之外，对拟南芥野生型和CkPHB-OE株系的叶片石蜡切片进行番红-固绿二重染色观察(图5)。结果表明，拟南芥CkPHB-OE株系比野生型拟南芥维管束体积增大，木质部导管数量增加。对拟南芥CkPHB-OE株系中与导管发育相关的基因表达水平进行定量分析，与细胞凋亡相关的XCP2、纤维素合成酶及木质素合成途径关键酶基因在过表达CkPHB基因植株中均上调表达(图6)。

CkPHB-OE. 拟南芥转CkPHB基因过表达株系T3代植株；WT. 拟南芥野生型。下同图4 拟南芥CkPHB-OE株系与野生型叶脉密度比较CkPHB-OE. A. thaliana transgenic CkPHB gene overexpression line T3 generation plant; WT. A. thaliana wild type. The same as belowFig.4 Comparison of leaf vein density between A. thaliana CkPHB-OE Strain and wild type

TE. 导管元件；标尺=50 μm图5 拟南芥CkPHB-OE株系与野生型叶脉木质部结构特征比较TE. Tracheary element; Scale = 50 μmFig.5 Comparison of leaf vein xylem structure between CkPHB-OE strain and wild type of A. thaliana

*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001图6 拟南芥导管发育相关基因的表达分析*. P<0.05; **. P<0.01; ***. P<0.001Fig.6 Expression analysis of genes related to vessel development in A. thaliana

2.3 拟南芥CkPHB-OE株系抗旱性分析

转基因拟南芥种子置于4 ℃避光春化2 d后，经含有潮霉素的1/2 MS培养基筛选，将阳性植株与野生型拟南芥幼苗移栽至土里，约15 d左右开始进行干旱处理。相比于野生型拟南芥，转基因拟南芥在干旱胁迫条件下的生存率显著提高，相比于拟南芥野生型具有明显更好的生长状态，抗旱能力明显提高(图7，A)。采集相应处理植物样本进行生理指标测定，结果显示，拟南芥CkPHB-OE株系相比于野生型，在干旱条件下具有更低的丙二醛含量以及相对电导率，同时积累了相对更多的脯氨酸。表明，CkPHB-OE株系比野生型拟南芥具有显著更轻的胁迫水平(图7，B)，进一步验证了上述结论。

A. 拟南芥干旱处理表型观察，Line 1-3表示转CkPHB基因拟南芥不同株系; B. 不同小写字母表示处理间在0.05水平差异显著图7 转CkPHB基因拟南芥株系的抗旱能力及其生理特性A. The phenotype observation of A. thaliana under drought treatment, Line1-3 represented different lines of CkPHB transgenic A. thaliana; B. There was a significant difference at the level of 0.05 between different normal lettersFig.7 Drought resistance and physiological characteristics of CkPHB transgenic A. thaliana strains

3 讨 论

干旱胁迫作为世界范围内影响作物产量的重要制约因素之一，极大地影响了植物的生长发育[3]。植物在长期应对干旱并产生适应性进化的过程中，逐步形成一系列迅速感知外界环境变化并随之主动应答的适应机制，从而能够缓解干旱胁迫造成的损伤[15]。叶脉维管系统主要通过木质部运输水分和无机盐，并通过韧皮部输出光合产物。植物在干旱胁迫下形成更加发达的叶脉从而提高水分运输效率，加强对水分的吸收，这种应对干旱胁迫的表型已经引起了更多的关注[27-29]。本研究发现拟南芥CkPHB-OE株系叶脉密度趋于发达，与前人报道一致，在干旱胁迫条件下，发达的叶脉显著提高了拟南芥CkPHB-OE株系的抗旱能力。

HD-ZIP Ⅲ家族在胚胎模式形成、分生组织维持、叶片发育、维管系统发育、花序结构以及对环境信号的响应和衰老调节中发挥着广泛的调控作用[20-24]。PHB是HD-ZIP Ⅲ转录因子家族的成员之一，被认为参与了叶片近轴面特征的建立和顶端分生组织的发育[8-9]。尽管phbphv单突变体及双突变体没有产生明显的表型变化，但revphbphv三重突变体加剧了rev单突的表型，表现出导管的数量和体积显著减少。虽然phbphv突变体没有观察到表型的变化，但与拟南芥野生型相比，拟南芥phb-d和phv-d株系表现出叶片远轴面特征向近轴面特征转变，木质部趋于发达，同时拟南芥revphbphv三重功能获得型突变体进一步加强了rev-10d的表型，木质部导管数量显著增多[8-11, 25-26]。对拟南芥CkPHB-OE株系叶脉切片进行番红-固绿二重染色，相比于拟南芥野生型株系，转基因拟南芥叶脉维管束木质部趋于发达，且转基因拟南芥中与导管发育相关的基因表达量均被CkPHB上调，与先前phb-d株系拟南芥表型结果一致[11]，表明CkPHB蛋白结构的改变并未使其功能受到显著影响。

本研究以广泛生长于中国西北干旱半干旱地区的耐旱植物柠条锦鸡儿为研究对象，克隆得到了柠条锦鸡儿中HD-ZIP Ⅲ家族成员CkPHB基因，其全长序列1 170 bp，并对其蛋白结构、理化性质以及调控功能做了初步的探究。免疫组化结果表明，CkPHB定位于柠条锦鸡儿叶脉木质部区域，与水稻HD-ZIP Ⅲ家族成员OsHB3及OsHB4具有相同组织定位[30]。在拟南芥中进行功能验证发现，拟南芥CkPHB-OE株系相比于野生型拟南芥，维管束体积增大，木质部导管数量同样增加。对转基因拟南芥进行干旱处理发现，相比于野生型拟南芥，具有更加发达木质部导管的CkPHB-OE株系拟南芥的抗性生理指标显著提高导致抗旱能力增强。本研究证实CkPHB在促进叶脉发育提高植物抗旱性中发挥重要作用，但其具体的调控机制还有待进一步研究。