青藏高原钻叶龙胆的遗传分化与种群动态历史研究

付鹏程，刘玉玉，史明艳

(洛阳师范学院 生命科学学院，河南洛阳 471934)

青藏高原地区是全球生物多样性热点地区之一[1]，孕育了大量特有物种，是研究植物遗传分化与适应性进化的热点地区[2-4]。大量生物地理学研究[5-7]和谱系地理学研究[4, 8]均表明，青藏高原地区植物遗传分化受到了造山运动和冰川运动及其引发的环境与气候变化的深刻影响[4, 8-10]。然而，不同物种对环境与气候变化的响应模式存在较大的差异。例如，不同植物具有不同类型的冰期避难所与扩张模式[10]，高山植物对全球气候变化的响应有别于低海拔植物[11]。因此，探讨青藏高原地区植物尤其是特有物种的遗传分化及其对过去环境与气候变化的响应模式，可以为深入理解全球气候变化背景下的植物进化与多样性形成提供参考。

龙胆属植物是典型的高山植物，以青藏高原及其周边地区为分布中心和分化中心，不仅是中国植物多样性的重要组成部分，还具有很高的药用和观赏价值[12]。龙胆属共分为14个组，其中小龙胆组(sectionChondrophyllaes.l.)是龙胆属中最大的类群，大多数为一年生草本，共有168种，占龙胆属物种总数的46.41%[12-14]。已有的进化研究表明，小龙胆组是一个快速分化类群[15-16]，起源于青藏高原地区，随后扩散到东亚、欧洲和美洲等地[17]。目前已对少量龙胆属物种开展了遗传分化和谱系地理学研究[18-22]，对龙胆属的物种形成及其对气候变化的响应模式等科学问题有了初步认识，但无一涉及小龙胆组这一庞大的类群，对小龙胆组在青藏高原的遗传分化及其对气候变化的响应缺乏了解。

钻叶龙胆(GentianahaynaldiiKanitz)是小龙胆组中的常见物种之一，一年生草本，二倍体(2n = 18、20)[23-25]，是青藏高原特有植物。钻叶龙胆曾隶属于柱果组(sectionDolichocarpa)[12]，但由于柱果组在分子系统发育树中不是一个单系群[13,17,26]，在最新的龙胆属分类系统中，柱果组已合并到小龙胆组中[14]。叶绿体基因组的比较研究表明，钻叶龙胆的叶绿体基因组发生了大量基因缺失和序列缺失，变异模式与小龙胆组其他物种类似，可能与适应青藏高原的气候变化有关[17]。

本研究以青藏高原地区的钻叶龙胆种群为研究对象，结合母系遗传和双亲遗传的分子标记探讨钻叶龙胆的种群遗传分化和种群动态历史，以期为龙胆以及高山植物的进化研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 样品采集

在青藏高原地区采集钻叶龙胆11个种群共135个个体，基本覆盖该物种的地理分布范围，种群内每个个体间距至少10 m。由于钻叶龙胆植株矮小，选取整株用干燥硅胶快速干燥，密封保存于-20 ℃中。凭证标本存于洛阳师范学院标本馆。详细的采样信息见表1。

1.2 方 法

1.2.1 分子数据获取用CTAB法[25]提取总DNA，用1%琼脂糖检测。选用通用的ITS1a-ITS4引物[27]和叶绿体trnS-trnG引物[28]进行PCR扩增，扩增体系和扩增反应参见文献[21]。将PCR产物纯化后用ABI3730xl(Applied Biosystems, USA)进行测序。

1.2.2 遗传分化与种群动态分析使用软件GENEIOUS PRO 3.5.6[29]查看测序结果，并进行序列比对。在软件DnaSP 5.1[30]中统计单倍型个数，对于有杂合位点的ITS序列，用PHASE[31]按默认参数进行基因分型。在ARLEQUIN 3.5[32]中计算基因多态性(h)与核苷酸多态性(π)，并通过分子变异分析(AMOVA)[33]检测遗传变异在居群内和居群间的分布情况。用PERMUT[34]计算居群遗传分化系数GST和NST，并对算得的GST和NST做1 000次重复的置换检验，以检测单倍型的分布是否具有显著的地理结构。在ARLEQUIN 3.5[32]进行歧点分布(mismatch distribution)分析和中性检测分析，计算Fu’sFs[35]和Tajima’sD值[36]。

采用最大似然法，在IQ-TREE[37]中基于单倍型构建系统发育树，核苷酸替换模型由IQ-TREE自动计算，设置Bootstrap为1 000。用最大简约法在软件NETWORK 4.6[38]中构建单倍型的中央网络连接图。

用软件BEAST 1.7.5[39]，基于贝叶斯马尔科夫链-蒙特卡洛链方法(Bayesian MCMC)估算钻叶龙胆各支系的分化时间。选用Yule process、严格分子钟模型进行计算。由于龙胆属已发现的化石非常少，加之本研究中未包含龙胆属全部主要类群，因此采用两种方法对分化时间估算进行校正。首先，选用龙胆属仅有的秦艽化石来标定外类群的共同祖先时间[17]；其次，依据Favre等[17]的结果，约束龙胆属冠群时间的中位数为29.76个百万年(Ma)。分析时做3次独立运算，每次运算10 000 000代，每隔1 000代取一棵树，去掉前20%的预热树(burn-in)。用Tracer 1.5(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tracer/)查看有效采样规模(effective sample size, ESS),保证所有指标均大于200。采用TreeAnnotator 1.7.5[40]基于有效树产生一棵分支分化时间树。

1.2.3 物种分布模型从GBIF(Global Biodiversity Information Facility)中下载钻叶龙胆的分布记录，结合本研究记录的物种分布记录，在ArcGIS 10.2中移除间距小于10 km的分布点。从WorldClim下载目前、中全新世(mid-Holocene，～6 kya)、末次盛冰期(LGM，～22 kya)和末次间冰期(LIG，～120-140 kya)的19个生物气候因子。为了避免多重共线性的影响，在SPSS 2.0中计算生物气候因子间的皮尔森相关系数，去掉皮尔森相关系数显著大于0.9的生物气候因子。用软件MaxEnt 3.4.1[41]预测钻叶龙胆在不同时期的物种分布范围。将75%的分布数据用作训练集，剩下的25%用作测试集，用AUC值对模型进行评估。

2 结果与分析

2.1 遗传分化与遗传结构

叶绿体分子标记在钻叶龙胆中共有4处碱基替换和一处缺失/插入，共鉴定7个单倍型(cH1—cH7；GenBank登录号MT492502—MT492508)。香格里拉(XGLL)和玉树(YS2)种群包含的单倍型较多，分别是4个和3个，而有4个种群仅包含1种单倍型(表1，图1)。核分子标记在钻叶龙胆中共有30处碱基替换，共鉴定78个基因型(H1—H78；GenBank登录号MT483797—MT483859)，其中大部分基因型为单个种群所独有(表1，图1)。叶绿体数据和核基因数据均表明，香格里拉(XGLL)、道孚(DF)和甘孜(GZ)种群的遗传多样性最高。基于叶绿体数据计算得到的遗传分化系数GST和NST分别是0.178和0.574(P<0.05)，基于核基因数据算得的遗传分化系数GST和NST分别是0.511和0.630(P<0.01)，均表明钻叶龙胆具有显著的谱系地理结构。分子变异分析的结果表明，钻叶龙胆中发生在种群间的遗传变异略高于发生在种群内的变异；其中种群间的遗传变异在叶绿体数据中占比53.14%，在ITS数据中占比51.12%(表2)。遗传分化系数FST在叶绿体数据和ITS数据中分别为0.531和0.511。

表1 本研究中钻叶龙胆的样品信息与遗传多样性指数

钻叶龙胆叶绿体单倍型间没有清晰的系统发育关系，分化时间分析表明钻叶龙胆叶绿体单倍型的分化发生在1.6 Ma(95%置信区间: 0.66-2.65 Ma)(图2，A)，在地质时间上处于第四纪更新世。中央网络连接图表明单倍型cH2位于网络中央，表明钻叶龙胆种群大小在近期发生过扩张(图2，B)。

表2 钻叶龙胆种群分子变异分析

A.枝上数值表示贝叶斯后验概率，主要节点的分化时间用箭头表示，灰条表示95%的置信区间；B. 图中圆圈大小表示单倍型数量图2 基于叶绿体数据的钻叶龙胆单倍型(cH1-cH7)分化时间(A)与中央网络连接图(B)A. Numbers on the branches indicate Bayesian posterior probabilities; node age estimates are marked with black arrows; grey bars represent 95% highest posterior densities； B. Pie charts display number of each haplotypeFig.2 Results of divergence time and median-joining network among chloroplast haplotypes (cH1-cH7) in Gentiana haynaldii

2.2 种群动态历史与物种历史分布范围

基于叶绿体和ITS数据的分析结果表明，钻叶龙胆的歧点分布图均为多峰曲线(图3)，说明在较长时间段内种群大小相对稳定。基于叶绿体数据的中性检验结果显示，Fu’sFs为-2.247(P=0.154)，Tajima’sD为-0.533(P=0.389)；ITS数据显示Fu’sFs为-24.532(P=0)，Tajima’sD为1.229(P=0.909)。

A. 叶绿体数据；B. nrITS数据图3 钻叶龙胆歧点分布分析曲线图A. Plastid data; B. nrITS dataFig.3 Result of mismatch distribution analysis of Gentiana haynaldii

通过泊松相关性分析，保留了9个生物气候因子(bio1-bio4，bio7，bio12-bio15)用于钻叶龙胆的历史分布区重建。结果表明，钻叶龙胆从末次间冰期到现在的历史分布范围比较稳定，仅在全新世中期有小幅度的收缩，随后向北小幅扩张到现今的分布范围(图4)。

A.现在; B. 中全新世(～6 kya); C. 末次盛冰期(～22 kya); D. 末次间冰期(～120-140 kya)图4 基于物种分布模型模拟钻叶龙胆的潜在适宜分布区A. Current; B. Mid Holocene (～6 kya); C. Last Glacial Maximum (～22 kya); D. Last Interglacial (～120-140 kya); The value of predicted habitat suitability is indicated by the bars in each panelFig.4 Estimated climatic niches for distribution of Gentiana haynaldii

3 讨 论

本研究表明，小龙胆组钻叶龙胆经历了近期的种内遗传分化，遗传多样性较高。钻叶龙胆的遗传分化系数FST在叶绿体数据和ITS数据中分别为0.532和0.511，高于龙胆属其他多年生物种，如阿墩子龙胆(G.atuntsiensisW.W. Smith，FST= 0.232，AFLP数据)[42]、多花龙胆(G.striolataT.N. Ho，FST= 0.226，AFLP数据)[42]、何氏秦艽(G.hoaeP.C. Fu & S.L. Chen,FST= 0.185，叶绿体数据；FST= 0.423，ITS数据)[21]、线叶龙胆[G.lawrenceivar.farreri(Balf. f.) T. N. Ho,FST= 0.488，叶绿体数据；FST= 0.175，SSR数据][19]。虽然目前已对青藏高原地区植物开展了大量遗传分化与进化研究，但绝大多数以多年生植物为研究对象，以一年生植物为对象的进化研究较少，仅见于一年生植物星叶草(CircaeasteragrestisMaxim，FST= 0.128-0.891，基因组数据)[43]和二年生植物羽叶点地梅(PomatosacefiliculaMaxim.，FST= 0.560，叶绿体数据)[44]等，二者种内遗传分化程度均很高，与钻叶龙胆相似。虽然不同研究所用分子标记的遗传方式和分辨率有所不同，遗传分化系数FST绝对值不能简单进行直接比较，但这些结果也足以表明钻叶龙胆种内遗传分化程度高，且普遍高于多年生龙胆属植物。

钻叶龙胆的高遗传分化程度可能有四方面的原因。第一，钻叶龙胆是一年生草本植物，由于世代周期短，进化速率快[15-16]，加速了遗传变异的积累。第二，自花授粉植物由于基因流减弱，利于遗传分化的发生。虽然目前缺乏详细的钻叶龙胆传粉生态学资料，但由于小龙胆组植物多为自花授粉，钻叶龙胆也具备自花授粉的形态特征[12]，因此，其传粉生态学特征也是钻叶龙胆遗传分化程度高的成因之一。第三，钻叶龙胆分布地区多为山脉峡谷地貌，易于形成片段化生境，起到了降低居群间基因流的作用，从而促进了种内的遗传分化。第四，过去环境与气候变化对种群动态的影响。基于分子钟模型的估算表明钻叶龙胆的种内分化发生在第四纪冰期以来。该时间段的青藏高原地区无剧烈的造山运动，以反复的冰川运动为主[3, 5]，因此，第四纪冰期以来的环境与气候变化是钻叶龙胆遗传分化的主要外部诱因。由于钻叶龙胆是典型的高山植物，分布海拔范围为2 100～4 200 m[12]，因此在气候变冷时其分布范围在青藏高原地区倾向于增大，而在气候变暖时其分布范围缩小，这与本研究的物种分布模型结果以及其他高山植物相一致[11]。在应对环境与气候变化过程中的生境片段化和天空岛效应(sky island)[45-46]可能是钻叶龙胆遗传分化的主要机制。

叶绿体数据显示钻叶龙胆种群的遗传多样性水平在云南与四川西部较高。虽然该地区是众多高山植物的冰期避难所[8-10, 47]，由于钻叶龙胆分化时间较短，本研究中单倍型间的系统发育关系不够明确，无法确定种内单倍型的进化历程，因而基于现有数据尚无法鉴定出一个明显的冰期避难所。此外，核基因数据显示钻叶龙胆没有明显的遗传多样性中心与分化中心，大部分单倍型为种群所独有。这种分布式样与一些高山植物和冰缘植物类似[10, 48]。

种群进化历史分析结果中，中性检验和中央网络图表明钻叶龙胆发生整体扩张，但歧点分布分析结果表明其近期种群大小稳定。不同种群进化历史分析方法的结果不一致在基于DNA片段数据分析时比较多见，如青藏高原一些冰缘植物[48]等。这种不一致可能有多种原因，包括复杂遗传结构和有限的变异位点均可能对歧点分布分析产生影响。因此，钻叶龙胆的种群进化历史还有待进一步研究。