一测多评法同时测定斑花黄堇药材中4种生物碱成分

杜 清，陈 志，吴 江，刘明地，郭苏城，候永强

1.青海民族大学药学院 青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室 青海省药物分析学重点实验室，青海 西宁810007

2.青海师范大学 青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海 西宁 810007

3.青海民族大学化学与化工学院，青海 西宁 810007

4.青海民族大学生态环境与资源学院，青海 西宁 810007

罂粟科（Papaveraceae） 荷包牡丹亚科（Fumarioideae）紫堇属CorydalisL.的植物全世界有428 种，中国有298 种，其中斑花黄堇Corydalis conspersaMaxim.Fl.Tang.为紫堇属多年生草本植物[1]，青藏高原和西藏地区有210 多种[2-3]，藏医作为“当日丝哇”使用[4]。紫堇属的植物含有多种生物碱成分，主要包括异喹啉类、有机胺类、异吲哚类、原阿片碱类、原小檗碱类、苯酞异喹啉类、螺苄异喹啉类、苄基异喹啉类、阿朴菲类、枯拉灵类、苯菲啶类及其他类别的异喹啉类生物碱[5]。研究表明斑花黄堇中含有黄连碱、巴马亭、原阿片碱、血根碱、比枯枯灵、紫堇碱、四氢非洲防己胺7 种生物碱成分[6-7]。

根据已有研究报道[8]，《中国药典》2020年版中对于药材中生物碱的检测情况及斑花黄堇药材质量标准制定的要求，本研究采用一测多评法首次测定斑花黄堇各个部位中盐酸小檗碱、黄连碱、原阿片碱、比枯枯灵4 种生物碱的含量，为斑花黄堇药材的质量控制提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

1.1.1 斑花黄堇药材的采集及处理 药材于2017年8月采于青海省黄南州河南县吉岗山、青海省海北藏族自治州祁连县祁连山、青海省玉树藏族自治州囊谦县香龙峡谷山、青海省海南州贵德县拉脊山，经青海民族大学林鹏程教授鉴定为斑花黄堇C.conspersaMaxim.Fl.Tang.，样品信息见表1。将新鲜植物清洗干净后，分成根、茎、叶、花不同部位，阴干，粉碎后过60 目筛备用。

表1 斑花黄堇样品信息Table 1 Sample information from C.conspersa

1.1.2 对照品及试剂 对照品盐酸小檗碱购于北京北纳创联生物技术研究院（批号633-65-8），质量分数大于98%；黄连碱购于上海宝曼生物有限公司（批号 170316YX-1）；原阿片碱（批号161223WTA）、比枯枯灵（批号161009HXY）购于上海宝曼生物有限公司，质量分数大于98%；乙腈（Fisher Chemical，HPLC 级，LOT166579）。浓盐酸（天津市博迪化工有限公司）、氢氧化钠、无水乙醇、95%乙醇（国药集团化学试剂有限公司），甲醇（西陇化工股份有限公司），二氯甲烷（天津富宇化学试剂公司），水（杭州娃哈哈有限公司），以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Waters Alliance 高效液相色谱系统：配有2695 溶剂管理系统、2996 二极管阵列检测器和Empower 色谱工作站，仪器型号分别是Waters2695 和岛津LC-20AT，UV-2450 紫外-可见分光光度计（岛津公司），AYALA 旋转蒸发仪N-1100（上海爱朗仪器有限公司），实验室专用超纯水机（沃特普公司），SB5200 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），微量移液器（ORAGON LAB），BSA1245 型电子天平（德国赛多利斯公司）。

色谱柱均为C18柱，分别摇光B18120405.25（江苏汉邦科技有限公司）、Phenomenex（飞诺美公司）和6L Sciences（日本GL Sciences），无菌注射器（江苏常州医疗器械总厂），微孔滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）。

2 方法与结果

2.1 提取条件的选择

生物碱成分可应用酸提碱沉法[9-10]提取分离，斑花黄堇中总生物碱提取工艺[11]，采用0.5%盐酸提取后用5%氢氧化钠碱沉，调至不同pH 值（pH 8～9、10～11、11～12），静置过夜后，将各种碱性水溶液分别用二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇萃取3 次后合并相同萃取溶剂的萃取液，旋转蒸干有机溶剂后用95%乙醇溶解移液至量瓶，定容至10.0 mL 后，用紫外分光光度计在波长200～550 nm 处扫描紫外吸收情况，每份溶液平行测定3 次。斑花黄堇药材中的生物碱成分极性较低，pH 9～12 二氯甲烷萃取相95%乙醇溶液在波长200～350 nm 及430 nm 左右都有多个吸收峰，且强度和吸光度均较强，尤其pH 11～12 各个峰的吸光度最大；而各种pH 条件下醋酸乙酯、正丁醇萃取相的95%乙醇溶液在波长200～350 nm 未见强的吸收峰，尤其430 nm 左右均未见吸收峰（盐酸小檗碱95%乙醇溶液的吸收峰之一），故选择二氯甲烷萃取碱沉溶液（pH 11～12）提取斑花黄堇总生物碱[11]。

2.2 色谱条件

色谱柱：B18120405.25 摇光C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.2%的醋酸水溶液，梯度洗脱，0～5 min，25%乙腈；6～10 min，25%～30%乙腈；11～15 min，30%～35%乙腈；16～25 min，35%～25%乙腈。体积流量1.0 mL/min；检测波长为245 nm；柱温30 ℃；进样量50 μL。

2.3 溶液的制备

2.3.1 单一对照品溶液 精密称取盐酸小檗碱、黄连碱、原阿片碱和比枯枯灵对照品各适量至容量瓶中，95%乙醇溶解，配制成含盐酸小檗碱、黄连碱、原阿片碱和比枯枯灵0.216、0.024、0.190、0.060 mg/mL的单一对照品溶液，以上溶液超声10 min，摇匀，定容，静置备用。

2.3.2 混合对照品溶液 分别用移液枪精密吸取盐酸小檗碱、黄连碱、原阿片碱和比枯枯灵的单一对照品95%乙醇溶液各0.5 mL，加入至2.0 mL 量瓶混匀，密封，静置备用，此时混合对照品溶液中盐酸小檗碱、黄连碱、原阿片碱和比枯枯灵的质量浓度分别为0.054、0.006、0.047 5、0.015 mg/mL。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密称取斑花黄堇药材粉末0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.5%盐酸溶液20 mL，密塞，超声10 min，静置过夜，抽滤酸提取溶液后用5%NaOH 沉淀，用酸度计调pH 值至11～12，超声10 min 后静置过夜，用二氯甲烷每次30 mL，萃取3 次后的萃取液放置于250 mL三角锥形瓶中，旋干有机溶剂，用95%乙醇溶液溶解，超声5 min，摇匀并定容至2.0 mL 量瓶，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，密封。

2.4 方法学考察[12-13]

2.4.1 专属性试验 应用“2.2”项色谱条件下进样，混合对照品溶液和斑花黄堇药材供试品溶液中的盐酸小檗碱、黄连碱、原阿片碱和比枯枯灵4 个生物碱峰和峰之间的分离度均＞1.5，理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算不低于4000，混合对照品及供试品的色谱图见图1。

图1 混合对照品 (A) 和斑花黄堇样品 (B) HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A) and C.conspersa (B)

2.4.2 线性关系考察 精密吸取“2.3.2”项中混合对照品溶液各50、35、25、15、10、1 μL 进样分析，每个质量浓度进样3 次，取平均值。分别以对照品质量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线并进行回归计算，得各对照品的标准曲线回归方程及线性范围，同系列混合对照品按照制备方法逐级稀释，分别以信噪比3 和10 考察检测限和定量限，结果见表2。

表2 4 种生物碱对照品的线性关系和线性范围Table 2 Linear correlation and ranges of four alkaloids reference substances

2.4.3 精密度试验 精密吸取同一供试品（批号BHHJ-JGS-R）溶液50 μL 连续进样6 次，记录盐酸小檗碱、黄连碱、原阿片碱和比枯枯灵的保留时间和峰面积，结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD 分别为0.31%、0.53%、1.23%、0.26%；峰面积的RSD 分别为1.29%、3.63%、3.73%、1.45%。

2.4.4 稳定性试验 精密吸取同一供试品（批号BHHJ-JGS-R）溶液50 μL，分别于配制后的0、4、12、24 h 测定其中盐酸小檗碱、黄连碱、原阿片碱和比枯枯灵的保留时间和峰面积，得保留时间的RSD分别为0.93%、1.13%、1.12%、0.15%；峰面积的RSD分别为1.52%、1.97%、1.84%、2.72%。

2.4.5 重复性试验 称取斑花黄堇药材根（批号BHHJ-JGS-R）粉末共6 份0.1 g，精密称定，按“2.3.3”项下制备样品，测定样品中盐酸小檗碱、黄连碱、原阿片碱和比枯枯灵的质量分数分别为969.64、773.83、432.59、500.64 μg/g，RSD 分别为3.64%、1.71%、2.80%、2.83%。

2.4.6 加样回收率试验 精密称取适量已测定的斑花黄堇粉末9 份，按“2.3.3”项下分别制备供试品溶液后定容至6.0 mL，取供试品溶液0.3 mL，分别精密加入“2.3.2”项下低、中、高3 个剂量的混合对照品各0.4、0.5、0.6 mL，每个剂量平行3 份，制备样品后混匀，按照色谱条件测定，计算盐酸小檗碱、黄连碱、原阿片碱和比枯枯灵的加样回收率分别为98.83%、102.03%、100.52%、100.47%，RSD 分别为1.31%、1.46%、0.45%、1.52%。

2.5 相对校正因子（fs/i）[13-14]的计算

采用多点校正法，精密吸取混合对照品溶液各30、35、40、45、50 μL，按照“2.2”项色谱条件进样，记录色谱图，每个质量浓度进样3 次，取平均值计算。以盐酸小檗碱（s）为内参物，根据fs/i的计算公式[fs/i＝fs/fi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)]计算比枯枯灵、黄连碱、原阿片碱与内参物盐酸小檗碱间的fs/i，结果3 个待测成分与内参物的fs/i的RSD 值均小于5%，见表3。

表3 不同进样体积对fs/i 的影响Table 3 Influence on relative correction factor from different injection volume

2.6 fs/i耐用性考察

2.6.1 不同柱温考察 采用Waters 2695 高效液相色谱仪和摇光C18色谱柱，考察不同柱温（25、30、35 ℃）对斑花黄堇中生物碱成分fs/i的影响，结果各种成分与内参物的fs/i重现性良好（RSD＜5%），见表4。

表4 不同柱温对fs/i 的影响Table 4 Influence on relative correction factor from different column temperature

2.6.2 不同体积流量考察 采用Waters 2695 高效液相色谱仪和摇光C18色谱柱，考察不同体积流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）对斑花黄堇中生物碱成分fs/i的影响，结果各种成分与内参物的fs/i重现性良好（RSD＜5%），见表5。

表5 不同体积流量对fs/i 的影响Table 5 Influence on relative correction factor from different volume

2.6.3 不同仪器和色谱柱的考察 分别考察了Waters 2695和岛津LC-20AT 高效液相色谱仪及瑶光C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）、phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）和6L Sciences（250 mm×4.6 mm，5 µm）色谱柱对fs/i的影响，检测波长为245 nm，并计算RSD，结果RSD 均小于5%，表明fs/i在不同的仪器和色谱柱的适用性良好，结果见表6。

表6 不同仪器和色谱柱对fs/i 的影响Table 6 Influence on relative correction factor from different instruments and columns

通过斑花黄堇中各种生物碱对于盐酸小檗碱的fs/i的测定和耐用性进行评价，结果表明，不同进样体积、不同柱温、不同体积流量、不同仪器和色谱柱对fs/i均无明显影响。

2.7 待测组分色谱峰定位

根据“2.5”项中得到的保留时间计算待测成分（i）与盐酸小檗碱（内参 s）的相对保留值（ri/s=tRi/tRs），对待测组分进行定位，并计算 RSD，结果各待测成分相对保留值的RSD 均小于5%，表明采用的研究体系能有效且稳定检测待测成分。结果见表7。

表7 不同条件下对ri/s 的影响Table 7 Influence of different injection volume,column temperature,volumn,instruments and columns on ri/s

2.8 药材中4 种生物碱的含量测定

将不同采集地区的药材，采用“2.3.3”项下方法制备样品并精密吸取溶液50 μL 自动进样器进样，每个样品重复测定3 次，取平均值。分别采用一测多评法[14]，以盐酸小檗碱对照品峰面积为对照，同时通过标准曲线法计算各个采样地区样品中的比枯枯灵、黄连碱、原阿片碱的含量及RSD 值，结果见表8，RSD均＜5.0%，计算结果并无显著性差异，说明一测多评法和标准曲线法均可行的。故应用一测多评法的结果绘制各个采样地区不同组织部位药材中4 种生物碱的含量和积累含量情况图，见图2、3。

表8 斑花黄堇药材中4 种生物碱的含量测定结果 (n＝3)Table 8 Determination results of four alkaloids from drugs of C.conspersa (n＝3)

从表8及图2、3 可看出，斑花黄堇药材各个组织中原阿片碱、盐酸小檗碱的含量较高，不同组织部位各种生物碱的含量差别较大。不同采集地区根部4 种生物碱的含量比茎、叶、花中高，因为生长年限和海拔高度、生态环境的不同，4 种生物碱成分的含量：根部海南州、玉树州地区高于黄南州、海北州；茎部玉树州地区高于海南州、黄南州、海北州；4 个采集地区叶、花部4 种生物碱的积累含量相对于根、茎部均较少。4 种生物碱中原阿片碱、盐酸小檗碱的含量在各个采集地区的根、茎、叶中含量较高，花中盐酸小檗碱的含量最高。该结果为今后药材质量标准的定量分析提供依据。

图2 不同来源斑花黄堇药材中生物碱的积累量Fig.2 Accumulated contents of alkaloids from different origin drug of C.conspersa

图3 不同来源斑花黄堇药材中4 种生物碱总量Fig.3 Contents of four alkaloids from different origin drug of C.conspersa

3 讨论

3.1 检测波长的选择

结合实际研究色谱图，可看到的波长有210、212、224、228、245、254、345、359、394 nm，对灵敏度、检测限和各个成分的分离度、最大吸光度情况进行考察，并结合已有的报道文献[15-16]，结果表明，检测波长为245 nm 时，基线较稳定，4 个生物碱成分的色谱分离度最好，且各个峰的吸光度最大，故以245 nm 作为检测波长。

3.2 色谱柱的选择

反相色谱是分析生物碱的常用方法，色谱柱的固定相采用常规的C18柱，高纯的硅胶基质，填料的粒径在5 μm，耐酸碱，且高密度键合和完全封尾的技术，选择pH 值1.5～10.5 宽范围以适应不同性质的生物碱，柱长为25 cm 达到有效分离。

3.3 检测方法和流动相的选择

目前可常规应用紫外和HPLC 的方法检测斑花黄堇药材中生物碱成分，本研究中对流动相的不同比例及不同pH 值的醋酸水溶液进行梯度洗脱，结果，pH 4.8 为最佳[17-18]，4 种生物碱成分的分离度最好，且4 个峰的保留时间均在11 min 以内。由此说明此研究实验中有机溶剂和酸水溶液配比的流动相能有效分离且节约时间有效检测出4 种生物碱成分。

HPLC 研究中应用酸提碱沉法精细分离出总生物碱，根据已有紫外分光光度法研究总生物碱的含量，可看出应用紫外吸收光谱检测的总生物碱的含量比单体生物碱成分的含量高的多，而同样单体生物碱成分用不同的取样量以及检测方法测定的含量也有不小的差别，会因为提取过程中的损失，也会因为检测的限度范围不同，尤其茎、叶花中各种生物碱的成分含量低。

志谢：青海师范大学陈克龙教授、马友贵教授、尚军教授、程子毓教授、熊雯豆、魏杰锋、李岭、焦璐等师生处理药材、准备仪器和实验条件；青海省药品检验检测院工作人员对于研究的支持。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突