平菇病害调查及病原菌分离鉴定*

华 蓉，李建英，刘绍雄，罗孝坤，王小艳，刘春丽，张丽英，孙达锋**

（1.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省供销合作社科学研究所，云南 昆明 650221；3.陆良爨乡绿圆菇业有限公司，云南 曲靖 655601）

平菇 （Pleurotus ostreatus） 中文学名糙皮侧耳，又名北风菌、冻菌、蚝菇等，隶属于担子菌门 （Basidiomycota） 层菌纲 （Hymenomycetes） 伞菌目（Agaricales） 侧耳科 （Plenrotaceae） 侧耳属（Pleurotus）[1]，其因价格低廉、味道鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱。平菇中蛋白质含量高，脂肪含量低，氨基酸含量丰富、种类齐全，膳食纤维、碳水化合物和矿质元素丰富，同时几丁质多糖、黄酮类、有机酸、多酚等生物活性物质含量较高，具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、降胆固醇、增强免疫力、护肝、促进大脑发育等多种医疗保健功效[2-7]。

我国是认识平菇最早的国家，南宋时期的陈玉卓在《菌谱》中写到的“天花蕈”就是平菇[8]。平菇产量高，生产成本较低，售价也相对较低。由于平菇市场需求量大，因此栽培面积较广，产业发展速度较快，目前已成为我国产量最大的四大食用菌栽培品种之一，也是我国经济效益较高的食用菌品种，具有较好的产业发展前景[9]。据中国食用菌协会统计，2019年平菇产量686.47万吨，比2018年增加42.95万吨[10]。平菇因其栽培技术门槛相对较低，适用的栽培基质较多，栽培规模需求灵活，成为发展“一县一业”和“一村一品”中的重点栽培品种，也是食用菌产业助推乡村振兴的主要品种。

陆良县是云南省第一大高原平坝，水资源丰富，属北亚热带冬干夏湿气候，适合食用菌生长，是云南省的食用菌大县[11]。陆良县平菇栽培规模位居全省首位，被中国食用菌协会评为“平菇生产基地”，是云南省绿色食品牌-食用菌产业发展的重点县，被列为“高原特色食用菌产业大县”[12-13]。陆良县平菇产业发展优势明显，但目前其平菇产业标准化、自动化生产程度不高，栽培技术规范化不够，产业技术集成创新不足，菌种生产和管理技术参差不齐，栽培过程中问题较多，且随着栽培年限增加，病虫害问题越来越严重，制约了平菇产业高质量发展。通过对云南陆良县平菇栽培过程中病害严重地区常见的病害及病原菌进行研究，调查了病害发生的原因，并对病原菌进行分离鉴定，以期能为云南陆良县平菇栽培管理及病害防治提供理论依据，为平菇菌种选育过程中筛选抗病性强的优良菌株提供供试菌株材料。

1 材料与方法

1.1 平菇病害调查和样品采集

1.1.1 样地概况

以云南省平菇栽培产量最大的陆良县内病害发生情况较为严重的地区，作为平菇病害调查地和样品采集地。具体采样地点为：马街镇赵官坝村（103°44′12.94″E，24°55′46.45″N，海拔 1 818 m），三岔河镇黄家圩村 （103°43′42.27″E，25°1′36.83″N，海拔 1 804 m），板桥镇河西堡村 （103°46′24.09″E，25°5′27.47″N，海拔 1 805 m），三岔河镇三岔子村（103°44′1.50″E，25°2′44.45″N，海拔 1 799 m），小百户镇上坝村 （103°35′25.36″E，25°6′34.73″N，海拔1 933 m）。

1.1.2 病害调查和样品采集

调查时间为2020年9月27日～28日，采集感染杂菌的平菇菌包。详细记录样品采集地平菇栽培情况、发病时间、病害发生规律、病害症状特点和样品采集时间等，并进行编号。样品装入样品采集袋中后，用冰盒保存带回实验室进行病原菌分离。

1.2 平菇病原菌分离鉴定

从病害情况调查结果可知，平菇病害主要由真菌引起，因此本次研究主要针对真菌进行分离鉴定。

1.2.1 培养基制备

孟加拉红培养基：蛋白胨0.5%、葡萄糖1%、琼脂1.5%～2.0%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、氯霉素0.01%、1/3 000孟加拉红溶液10%，蒸馏水1 000 mL。

PDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖 2%、琼脂1.5%～2.0%，蒸馏水1 000 mL。

1.2.2 病原菌分离与纯化

在超净工作台进行无菌操作，从染病的菌包上直接挑取小部分杂菌菌丝，接种在孟加拉红培养基平板上，置于24℃培养箱中进行避光培养。培养3 d～6 d后，挑取病原菌菌落边缘部分菌丝或带菌丝的培养基至PDA平板上进行纯化，重复操作直至获得单一的菌落，于3℃～5℃冰箱中保存备用。

1.2.3 菌株鉴定

采用rDNA ITS序列分析法[14-16]对纯化的病原菌菌株进行分析鉴定，样品送至昆明硕擎生物科技有限公司进行DNA提取和测序，序列经过DNASTAR软件进行拼接处理后在NCBI数据库中进行BLAST序列比对，下载与样品序列相似度较高的序列，用MEGA 6软件构建系统发育树，确定菌株的系统学发育地位。

2 结果与分析

2.1 平菇常见病害调查结果与分析

陆良县作为平菇栽培重点县，栽培多年后病害问题日益凸显，通过本次调查发现，陆良县平菇病害主要以真菌感染为主。不同的管理方式和不同的栽培场所病害发生程度差异较大。调查结果详见图1和表1。

由图1和表1可知，此次陆良县平菇病害调查，共采集病害样品8份，采集地5个，其中4份样品（4号～7号）采集自同一个采集地的3家栽培户和1家菌包生产公司（陆良爨乡绿圆菇业有限公司）栽培基地。从调查结果可知，平菇病害在菌丝培养阶段和出菇阶段都有发生，主要症状是菌包内部或出菇后的包口有杂菌感染，影响平菇产量。

图1 平菇病害症状Fig.1 Symptoms of disease of Pleurotus ostreatus

从表1中可以看出，样品1号和2号采集地的菌包由自己生产，常压灭菌，菌丝培养阶段开始发生病害，且开始感染的部位在菌包内部，说明感染是由菌包内部灭菌不彻底引起的。样品1号采集地病害发生很严重，样品2号采集地病害较轻。栽培户自己进行常压灭菌有一定风险，如果灭菌不彻底，菌包内部引起感染，感染情况较重的会严重影响出菇产量。样品3号～8号菌包均来自正规厂家，高压灭菌，菌丝培养阶段不易发生病害，病害主要在出菇后产生。说明公司统一标准化生产更能保障菌包的质量，减少污染率。发生病害部位主要从包口开始，说明病害是从环境中感染引起。样品7号为菌种生产公司的栽培基地，水分管理较差，病害为中度，其余5个栽培户管理较为精细，病害均较轻。说明在平菇栽培过程中，在保障菌包品质的前提下，管理水平不足是造成病害加剧的主要原因。样品1号采集地使用的品种平菇89是多年来平菇栽培中使用最多的品种，栽培户自己进行菌种多代转接，可能导致了菌种的退化，抗病性降低，也是导致病害严重的原因之一。样品2号采集地用的品种平菇9号是自己多年驯化选育出来的新品种，样品3号～8号都是菌种公司集中生产使用的新品种平菇灰2，从调查结果来看，平菇9号和平菇灰2的抗病性都较好。

表1 平菇病害调查结果Tab.1 Investigation results of diseases of Pleurotus ostreatus

根据病害调查结果分析发生病害的主要原因有4种。

1） 常压灭菌有一定风险，灭菌不彻底，有虫卵、杂菌残留。加之夏季温度高，在菌丝培养阶段若翻堆不及时会导致菌包内料温升高，平菇菌丝抗病能力下降，杂菌就会从菌包内部开始发生，蔓延至整个菌棒。并且虫害还会加速整个场地菌包感染的蔓延速度，从而极大地影响产量。

2）正规厂家统一生产的菌包，有标准化、规范化的操作流程和高压灭菌设施，能够在一定程度上保障菌包的品质。但是在后期管理阶段如果对水分的管理掌握不好，包口产生积水，也会导致菌包感染。在出菇后期，菌丝抵抗力变弱，感染就会加剧。

3）栽培户常年自己进行菌包制作，如果菌种转接次数过多，可能存在菌种退化的问题。品种本身对病害的抗性变弱，也会导致感染加剧。

4）平菇栽培一般可以采收三潮～五潮，从采收第一潮后，包口部位对外界病原菌的抵抗力会变弱。且随着采菇潮数的增加菌丝抗感染能力会越来越弱，在采菇二潮～三潮后感染率就会增加。

2.2 平菇病原菌分离

从采集到的病害样品中分离出优势病原菌，编号为PGB-1～PGB-8，分离结果见图2、表2。

由图2、表2可知，从陆良县5个地方8个样地采集到的8份病害样品中分离得到10个病原菌菌株。其中，5号和6号样品中分别分离到2个菌株。

表2 病原菌分离情况Tab.2 Isolation of pathogenic fungi

图2 病原菌菌落形态Fig.2 Colony morphology of pathogenic fungi

2.3 基于rDNA序列的病原菌系统发育分析

将 PGB-1、PGB-2、PGB-3、PGB-4、PGB-5、PGB-5-1、PGB-6、PGB-6-1、PGB-7、PGB-8 十个病原菌菌株的rDNA ITS序列在NCBI数据库中进行BLAST序列比对，下载相似度较高且已在期刊发表的序列，同时下载了8个已发表的同属序列作为对比序列，选取米根霉（Rhizopus oryzae）作为外群构建系统发育树，确定菌株的系统学分类地位，详见图3、表3。

由图3和表3可知，PGB-1、PGB-2、PGB-3、PGB-4、PGB-7、PGB-8病原菌菌株与木霉属的平菇木霉（T.pleuroti）ITS序列相似度达到100%，在系统发育树上也聚在同一支系上，结合菌落形态可确定从6个样品中分离到的病原菌菌株PGB-1、PGB-2、PGB-3、PGB-4、PGB-7、PGB-8均为平菇木霉（T.pleuroti）。PGB-5和PGB-6菌株与椰青霉菌（P.copticola）的序列相似度达100%，且系统发育树上聚在同一支系，结合菌落形态可确定从5号样品和6号样品中分离到的PGB-5、PGB-6两个菌株为椰青霉菌。PGB-5-1菌株与歧皱青霉（P.steckii）的序列相似度为99.83%，系统发育树中聚在同一支系上，结合菌落形态可确定菌株PGB-5-1为歧皱青霉（P.steckii）。菌株PGB-6-1与T.patella的序列相似度为99.64%，系统发育树中聚在同一支系上，结合菌落形态可确定菌株PGB-6-1为T.patella。

图3 基于ITS序列构建的NJ系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

表3 基于ITS序列系统发育树分析表Tab.3 Phylogenetic tree analysis table based on ITS sequences

3 结论与讨论

3.1 结论

云南陆良县平菇栽培过程中菌包感染是最为常见的病害症状，也是影响最为严重的问题，主要发生在菌丝培养阶段和第二潮菇采收后。菌丝培养阶段发生病害的栽培地菌包基本是家庭式生产，常压灭菌，病害发生原因为灭菌不彻底，发生感染的初期杂菌与平菇菌丝一同生长，后期杂菌逐渐覆盖平菇菌丝，蔓延至整个菌包，菌包变软、腐烂。

采收第二潮菇后开始发生病害的栽培地菌包基本为公司集中生产，高温高压灭菌，相对而言菌包品质更有保障。夏季气温升高、采菇后水分管理不当的情况下，易产生病害，多发生在包口，竞争性真菌感染后逐渐向包内蔓延至整个菌包。公司集中生产的菌包在不同的栽培基地表现出的污染情况有差异，说明同样的出菇包，后期产量和污染率与出菇阶段的管理技术关系较大。因此，在平菇栽培过程中，标准化的菌包制作和规范化的栽培管理能有效减少病害发生。

通过对分离纯化后的病原菌进行rDNA序列分析，结果表明导致平菇菌包感染的病原菌菌株PGB-1、PGB-2、PGB-3、PGB-4、PGB-7、PGB-8 均为木霉属的平菇木霉（T.pleuroti），病原菌菌株PGB-5、PGB-6为青霉属的椰青霉菌（P.copticola），菌株PGB-5-1为歧皱青霉（P.steckii），菌株PGB-6-1为 T.patella。

3.2 讨论

通过本次研究，共从8个陆良县平菇栽培地感染菌包中分离到10个病原菌菌株，其中样品1号、2号、3号、4号、7号和8号中均分离到木霉属的平菇木霉（T.pleuroti），说明平菇木霉是陆良县平菇病害的主要病原菌，在病害发生后作为优势菌造成大面积危害，后期病害防治中应对该种进行针对性防御。样品5号和6号中分别分离到2个菌株，有木霉属真菌和青霉属真菌，这两个栽培场地病害较轻，尚未形成优势病原菌产生较大的危害。

不同地区的病原菌菌株可能有所差异，曹现涛[17]、崔红丽[18]、颜一红[19]、刘正慧[20]等的研究表明，木霉属的长枝木霉 （T.longibrachiatum）和侧耳木霉（T.pleuroticola）、节从孢属 （Arthrobotrys）、尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）是平菇、杏鲍菇、香菇、木耳等食用菌栽培生产中的主要病原真菌。可以确定的是，木霉属真菌是平菇等食用菌栽培中的主要病原菌，且一旦发展为优势菌株产生大面积污染，将造成较大的损失，因此在实际生产和栽培中应根据木霉属真菌的生长特性进行针对性的防治。