麻黄-杏仁药对对磷酸组胺诱导的RTE细胞损伤的保护作用

张 颖，李文宏，肖 雄，雷 婷，周开放，敖 波，马嘉鑫，廖玉群

(1.江西中医药大学 药学院，江西 南昌 330000；2.新乡医学院三全学院，河南 新乡 453000；3.惠州市中信惠州医院 药学部，广东 惠州 516000；4.江西药都仁和制药有限公司，江西 樟树 331200)

药对，也称对药，是复方的主干，具有内在的组合变化规律，也是复杂方剂组成的基础[1]。麻黄-杏仁药对在多种著名方药中出现，并发挥主要作用[2]。张欢等[3]采用数据挖掘的方法，发现麻黄-杏仁药对是所有疗喘方中支持度最高的药对。气道上皮损伤与功能失调是哮喘发病的始动因素[4-6]。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)在维持上皮细胞稳定性、促进气道上皮组织修复方面起着至关重要的作用[7]。EGFR被活化后，通过激活其下游的三磷酸肌醇激酶(Phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)导致基底和损伤周围细胞增殖、分化、移行和脱颗粒，以补充损伤区的细胞，促进损伤修复[8]。Bax(Bcl-2 associated x，Bax)蛋白属于Bcl-2蛋白家族，是细胞凋亡的重要调节蛋白[9]，细胞凋亡可使细胞通透性发生改变最终导致细胞损伤[10-12]。本研究将通过多项实验探讨麻黄-杏仁药对对磷酸组胺诱导的大鼠气道上皮细胞损伤的保护作用。

1 仪器与材料

1.1 实验动物与细胞

SPF级雄性SD大鼠，体重(200±20)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2017-0004，动物使用许可证号：SYXK(赣)2019-0004，本研究实验动物的使用经江西中医药大学动物实验伦理委员会批准。大鼠气道上皮细胞(RTE细胞)购于中国医学科学院基础医学研究所。

1.2 药物与试剂

氯化乙酰胆碱(北京Solarbio，批号：313G011)；磷酸组胺(美国Sigma，批号：101516525)；布地奈德(AstraZeneca 公司，批号：MAKH)；BCA蛋白测试盒(康为世纪生物，批号：20146)；RIPA裂解液(强)(康为世纪生物，批号：50321)；蛋白酶抑制剂(康为世纪生物，批号：CW2200S)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(江苏凯基生物，批号：20180111)；PageRulerPrestained Protein Ladder(江苏凯基生物，批号：00395657)；SDS-PAGE电泳液(干粉)(江苏凯基生物，批号：KGP103X-1)；Western转膜液(干粉)(江苏凯基生物，批号：KGP102-2)；脱脂奶粉(美国 BD 公司，批号：4049465)；5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(江苏凯基生物，批号：KGP101)；Anti-EGFR antibody(abcam，批号：GR171256-1)；Anti-PI3K antibody(abcam，批号：GR3179297-1)；BAX Antibody(CST，批号：2772T)；MouseAntiβ-actin mAb(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：16AV0212)；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：124227)；辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：127760)；高灵敏度化学发光检测试剂盒(康为世纪生物，批号：40137)；MEM/EBSS 培养基(北京索莱宝科技有限公司，批号：20180820)；胎牛血清(美国Gibco，批号：1908121)；胰蛋白酶(美国Gibco，批号：1897330)；Trizol(美国Ambion公司，批号：160009)；Nuclease-Free Water(美国Ambion公司，批号：1604072)；逆转录试剂盒(北京普洛麦格生物技术有限公司，批号：0000303454)；FITC-BSA(上海恪敏生物科技有限公司，批号：20200501)；多聚甲醛-蔗糖(5%)(北京雷根生物，批号：0504A18)；1%TritonX-100溶液(北京雷根生物，批号：R00281)；DAPI染色液(北京雷根生物，批号：DA0004)；增强型抗荧光猝灭封片剂(北京雷根生物，批号：0504A18)；麻黄为麻黄科植物草麻黄EphedrasinicaStapf的干燥草质茎(产地：甘肃，批号：20180315)，苦杏仁为蔷薇科植物山杏PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim.的干燥成熟种子(产地：河北，批号：20180325)，均购自江西江中中药饮片有限公司，经江西中医药大学药学院付小梅教授鉴定均为正品。

1.3 仪器

高速低温离心机(德国 Eppendorf)；可调量程移液枪(德国Eppendorf)；MCO-17AIC型CO2培养箱(日本SANYO)；Milli-Q型超纯水仪(美国Millipore)；酶标仪(美国 Molecular Devices)；凝胶成像系统(德国Bio-Rad)；Western Blot 系统(德国 Bio-Rad)；荧光定量 PCR(美国ABI公司)；Mastercyclear PCR仪(德国 Eppendorf 公司)；分析天平(德国 Sartorius公司)；ThermoScientific NanoDrop TM 2000 Spectrophotometer(Thermo公司)；MILLICELL电阻测量仪ESR-2(Millipore公司)；DMI3000B型倒置荧光显微镜(德国Leica)；Transwell板(美国Corning Costar)。

2 方法

2.1 麻黄-杏仁药对含药肠吸收液的制备

参照临床煎药方法，按照各配比方量精密称取药材，将称取的麻黄药材加入方药总量8倍的水，浸泡30 min，加热至沸腾，然后改用小火煎煮30 min，加入苦杏仁药材煎煮40 min，趁热过滤，浓缩，定容至1 g 生药/mL。依据相关文献[13]方法制备麻黄-杏仁药对含药肠吸收液，腹腔麻醉后，小心将大鼠肠管与肠系膜剥离，分别切取空肠、回肠各10 cm，用KR液冲洗至无内容物，在不损伤肠管的情况下，剥离肠表面的脂肪及血管。将肠腔面向外翻出，用KR液冲洗后将一端结扎，使之形成囊状肠管。向肠囊内注入2 mL空白KR液，将其放入已有KR液的麦氏浴槽中，保持37 ℃ 恒温，并向浴槽中通入95% O2和5% CO2混合气体，平衡5 min后，将麦氏浴槽中的KR液倒出，待用。肠管平衡后，向麦氏浴槽中注入37 ℃ 恒温的各组1 g 生药/mL 麻黄-杏仁药对药液20 mL，肠管中加入2 mL KR液，温孵2 h 后取出并收集肠管中的KR液即得含药肠吸收液，其中NSA为NS配比组含药肠吸收液。各配比，见表1。

表1 麻黄-杏仁药对均匀设计实验配比方案

2.2 细胞分组及给药

将对数期生长细胞用胰酶消化，用细胞培养基(20% FBS+1%青链霉素混合液)将RTE按8.5×105个/皿接种于6 cm的培养皿中，5% CO2，37 ℃培养24 h。将细胞分成9组(正常对照组、模型组、布地奈德组、N1A组、N2A组、N3A组、N4A组、N5A组、N6A组)。正常组：细胞培养基2 mL，模型组和各给药组：各加入8×10-3mol·L-1的磷酸组胺2 mL，相互作用0.5 h后，正常组和模型组：各加入细胞培养基2 mL，布地奈德组：加入2×10-3mol/L的布地奈德2 mL，各受试药物组：加入相应的10%含药肠吸收液，作用24 h。

2.3 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测各组细胞EGFR、PI3K及Bax mRNA的表达

参照文献[14]方法，取药物作用24 h后的细胞，用RNA提取试剂盒提取总RNA，以Reverse Transcription 试剂盒按照试剂盒说明书操作，合成cDNA 第一链。目的基因EGFR、PI3K、Bax以及内参基因β-actin的引物序列见表2。每个PCR反应体系内容如下：SYBR Green Realtime Master Mix 10 μL，上、下游引物共1 μL，c DNA 1 μL，双蒸水8 μL。PCR反应条件：50 ℃，1 min 活化；95 ℃，1 min预变性。按95 ℃，3 s变性，60 ℃，30 s 退火，共40个循环。将PCR产物作熔解曲线，以证实以上PCR 反应产物特异性良好。统计2-ΔΔCt值以比较各组mRNA 的表达。

表2 EGFR、PI3K、Bax和β-actin的引物序列

2.4 蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测各组细胞EGFR、PI3K、Bax蛋白的表达

参照文献[14]方法。取药物作用24 h 后的细胞，用预冷的PBS洗涤，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂混合液，并吹打细胞。将裂解液转移到离心管中，冰上充分裂解20 min。14 000 r/min离心10 min，收集上清液即为待测蛋白，用BCA蛋白测试盒进行蛋白含量测定。蛋白变性后，以20 g进行SDS-PAGE电泳(7%分离胶，5%浓缩胶)。将蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭，随后进行相应抗体孵育，采用凝胶成像系统曝光进行显影、定影、分析。

2.5 荧光显微镜检测RTE细胞损伤模型对FITC-BSA的通透性

2.5.1 细胞分组及给药 将RTE细胞接种于6孔板Transwell小室中，每孔2 mL，外室加2 mL培养基，培养24 h，加入含2% FBS的培养基，饥饿处理12 h，待细胞形成单细胞层后，正常组给予含20% FBS的细胞培养基，模型组和各药物组加入8×10-3mol/L的磷酸组胺，作用0.5 h后，模型组加入细胞培养基，药物组分别换成含布地奈德及相应的含有肠吸收液的培养基，作用24 h。分组情况同“2.2”项。

2.5.2 跨细胞单层电阻值(TEER)测定 在超净工作台中用75%乙醇擦净电极，晾干，紫外照射30 min，在培养基中平衡45 min，电极与Transwell培养板成90°，短端放内室(勿接触细胞)，长端放外室(勿接触底部)。

2.5.3 荧光强度的测定 检测RTE细胞跨膜电阻后，吸出培养基，上室加入0.5 mL含FITC-BSA的无血清培养基，下室加入1.5 mL无血清培养基，37 ℃下孵育60 min收集下室液体，荧光酶标仪测量荧光强度；以对照组荧光强度为标准，计算相对大分子透过率，用荧光强度表示。

2.5.4 荧光显微镜观察RTE细胞通透性 荧光强度测定后PBS洗净上、下室，多聚甲醛-蔗糖(5%)室温固定20 min，PBS洗3次，0.1%TritonX-100孵育15 min，PBS洗3次，冰上DAPI复染5 min，PBS洗3次；封片，-20 ℃保存；荧光显微镜观察上皮细胞层对FITC-BSA的漏出量，拍照。

2.6 数据统计

3 结果

3.1 麻黄-杏仁药对对RTE细胞EGFR、PI3K、Bax mRNA表达的影响

RT-PCR结果显示(表3)：与空白组相比，模型组的RTE细胞中EGFR、PI3K、Bax mRNA相对含量显著升高(P<0.01或P<0.05)。与模型组相比，除N6A组外，麻黄-杏仁含药肠吸收液其余各组均可显著下调RTE中EGFR mRNA表达，其中N5A组效果最佳(P<0.01)(见图1)；与模型组相比，除N1A组外，麻黄-杏仁含药肠吸收液其余各组均可以显著下调RTE中PI3K mRNA表达，以N2A组效果最佳(P<0.01)(图2)；与模型组相比，麻黄-杏仁含药肠吸收液N2A、N3A可以显著下调RTE中Bax mRNA表达，以N2A组效果最佳(P<0.01)，见图3。

表3 麻黄-杏仁含药肠吸收液对EGFR、PI3K、Bax mRNA表达的影响

图1 麻黄-杏仁含药肠吸收液对EGFR mRNA表达的影响

图2 麻黄-杏仁含药肠吸收液对PI3K mRNA表达的影响

图3 麻黄-杏仁含药肠吸收液对Bax mRNA表达的影响

3.2 麻黄-杏仁药对对RTE细胞EGFR、PI3K、Bax蛋白表达的影响

表4结果显示，与空白组相比，模型组RTE细胞EGFR、PI3K和Bax蛋白相对含量均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。与模型组相比，麻黄-杏仁含药肠吸收液可以显著下调RTE细胞中EGFR蛋白表达，其中N6A组效果最佳，差异有显著统计学意义(P<0.01)；同时下调PI3K蛋白表达，其中N3A、N4A、N5A、N6A下降效果显著，以N6A组效果最佳，差异有显著统计学意义(P<0.01)；下调Bax蛋白表达，以N4A组效果最佳，差异有显著统计学意义(P<0.01)。各组EGFR、PI3K及Bax蛋白免疫印迹，见图4。

表4 各组样品中EGFR、PI3K和Bax蛋白的相对含量

注：A.正常组；B.模型组；C.布地奈德组；D.N1A组；E.N2A组；F.N3A组；G.N4A组；H.N5A组；I.N6A组。

3.3 麻黄-杏仁药对对组胺刺激大鼠气道上皮细胞损伤模型通透性的影响

由表5结果显示，空白组与模型组相比，差异有显著统计学意义(P<0.01)，下室荧光强度显著增加，跨细胞单层电阻值(TEER)显著降低，与图片呈现模型组RTE细胞FITC-BSA具有较高透过相符，磷酸组胺可以显著增加RTE细胞的通透性，表明模型组造模成功。与模型组相比，各配比含药肠吸收液组均具有升高TEER和降低透过率(荧光强度)的作用，其中N3A组升高TEER最为显著，N2A、N3A、N5A、N6A降低透过率较为显著(P<0.01)，其作用与布地奈德组升高TEER和降低透过率的作用相当。说明麻黄-杏仁药对可以通过改善细胞通透性来抑制磷酸组胺诱导的RTE细胞损伤。麻黄-杏仁各比例组调控细胞损伤模型对FITC-BSA通透性的影响，见图5。

表5 麻黄-杏仁对细胞损伤模型TEER和透过率的影响

图5 麻黄-杏仁调控细胞损伤模型对FITC-BSA通透性的影响(×200)

4 讨论

气道上皮细胞作为机体与外界环境接触的第一道屏障细胞，在气道局部炎症发生、发展过程中发挥着不可替代的作用。哮喘患者发病时，气道上皮主要伴随有杯状细胞增生、上皮细胞损伤脱落以及过度的黏液分泌等多种病理变化，且上皮细胞损伤范围与气道高反应性和上皮通透性呈正相关[15]。综上分析，缓解哮喘症状应从减轻气道损伤等方面作为切入点。

陈欧等[16]运用网络药理学的方法发现EGFR既是麻黄的抗炎靶点，又与哮喘相关。EGFR在哮喘发病者气道中有表达增加的现象，活化的EGFR参与气道黏液的产生及气道重塑[17]。一方面，EGFR的表达增多，有助于损伤的气道上皮细胞的修复；另一方面，EGFR过表达反而会使气道形成不可逆的重塑，伴随气道气流受阻症状，加重哮喘病情。同时，有研究还发现，EGFR及其配体结合被活化，会影响下游的PI3K信号通路的信息传递，加速细胞迁移和黏附[18]，使细胞更加迅速增殖，与本实验研究结果相符。在调节细胞生长、增殖、迁移、分化、凋亡和炎症反应等方面，均有PI3K/Akt 信号通路参与，并发挥重要作用[19-22]。Bax蛋白为促凋亡蛋白，而Bcl-2蛋白则是抑制细胞凋亡的抗凋亡蛋白。Bax和Bcl-2在激活状态下，这两者表达水平的高低直接与凋亡调控有着密切联系[23]。本实验研究表明磷酸组胺可导致Bax的高表达，诱发RTE细胞凋亡，产生损伤；麻黄-杏仁药对可使Bax的表达降低，使其处于稳定状态，通过抑制细胞凋亡保护磷酸组胺诱导的RTE细胞损伤，增强RTE细胞的修复和再生，让机体处于稳态环境。

麻黄-杏仁药对通过下调EGFR和PI3K，抑制炎症反应，通过下调Bax抑制细胞凋亡，进而修复细胞膜的完整性。细胞对大分子物质的通透性与TEER成反比，即电阻值越大反映细胞通透性越小，电阻值越小反映细胞通透性越大[24]。磷酸组胺作用于气道上皮细胞使其气道上皮细胞TEER降低、大分子通透性升高，显示气道上皮细胞屏障功能严重受损。不同配比的麻黄-杏仁药对提高了气道上皮细胞层电阻值，降低了其大分子通透性，从而不同程度修复了气道上皮细胞损伤，改善了气道上皮细胞屏障功能。实验结果显示，N3A组麻黄-杏仁药对可影响本研究的所有效应指标，说明该组可从多方面修复RTE细胞损伤。N3组麻黄和杏仁的用量比例接近1∶1，与经典名方麻杏石甘汤一致，反映了传统用药配伍比例的科学性。综上所述，麻黄-杏仁药对通过下调气道上皮细胞中EGFR和PI3K蛋白的表达、调节Bax凋亡蛋白的稳定性、降低细胞膜的通透性来减轻气道上皮细胞损伤，改善气道上皮细胞屏障功能。本研究也进一步表明含药肠吸收液用于中药复方体外药理研究具有客观性和可行性。