气相色谱串联质谱法测定藤茶中51种农药残留量

石依姗，肖 凌，聂 晶，胡 敏，方建国，吕 盼，3*

(1.华中科技大学同济医学院附属同济医院 药学部，湖北 武汉 430030；2.湖北省药品监督检验研究院，湖北 武汉 430075；3.湖北省药品质量检测与控制工程技术研究中心，湖北 武汉 430075)

藤茶是由葡萄科植物显齿蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang.)的嫩茎叶加工而成，其质量标准收载于《福建省中药材标准(2006版)》《湖南省中药材标准(2009版)》《广西壮族自治区壮药质量标准(第一卷)》。藤茶味甘淡，性凉，主要具有清热解毒、利湿消肿、平肝降压、活血通络等功效，一般用于咽喉肿痛、目肿痈疖等证的治疗[1-4]。

藤茶从最初的茶叶和茶基产品到药用再到临床，其保健和药用价值不断被挖掘，市场需求量急剧增加，从野生转化为人工种植是保证藤茶药材供应的必然途径。根据茶叶种植积累的经验，现代农业大量使用农药可能导致藤茶药材农药残留问题。为保证藤茶产业的健康发展，有必要建立相关的检测方法并对其农残状况进行科学分析，以加强对种植生产、监管的指导。

由于农药种类繁多、性质差异较大，现代质谱技术及串联质谱技术已广泛应用于农药多残留检测。藤茶中基质复杂，对样品前处理要求高，本实验针对藤茶基质特点利用串联固相萃取技术结合反复的浓缩冷却、滤过净化方法，采用GC-MS/MS 分析，建立藤茶中 51 种农药残留量的测定方法。

1 仪器与材料

Agilent 7000C GC-MS/MS(安捷伦科技有限公司)；ST16R离心机(赛默飞)；MS3 basic振荡器(德国IKA公司)；平行蒸发仪(Buch公司)；METTLER XP-205分析天平(梅特勒)；Eppendoff Reseach Plus移液器(德国Eppendof公司)。

分析保护剂D-山梨醇(Sigma，CAS：50-70-4)和D-核糖酸内酯(东京化成工业株式会社，CAS：53336-08-3)；磷酸三苯酯(Sigma，CAS：115-86-6)农药混合对照品(100 mg·L-1；天津阿尔塔)；丙酮、乙腈为农残级试剂 (德国Merck 公司)；Waters Oasis HLB萃取柱(3cc，60mg；Waters)；无水硫酸镁(美国SepaX)。

本研究共选取72批藤茶，由华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部方建国教授鉴定为显齿蛇葡萄Ampel1opsisgrossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang的干燥茎叶。样品信息见表1。

表1 藤茶样品信息

2 方法与结果

2.1 气相色谱-质谱检测条件

色谱柱：Agilent弹性石英毛细管柱DB-17MS (0.25 mm×30 m，0.25 μm)；程序升温：初始温度60 ℃，保持1 min，以30 ℃·min-1升至120 ℃，以10 ℃·min-1升至160 ℃，以2 ℃·min-1升至230 ℃，以15 ℃·min-1升至300 ℃，保持6 min，以20 ℃·min-1升至320 ℃，保持3 min；载气：高纯氦(纯度：99.999%)；柱流速：1.3 mL·min-1；进样口温度：250 ℃，脉冲不分流进样；进样量：1 μL；离子源温度：230 ℃；传输线温度：250 ℃；扫描模式：MRM；Agilent MassHunter数据采集软件(Ver.B.07.04)；MassHunter Workstation定性分析软件(Ver.B.07.00)；MassHunter Workstation定量分析软件(Ver.B.07.01)。各化合物具体离子对及CE值，见表2。

2.2 对照品与供试品溶液的制备

2.2.1 内标分析保护剂的配制 配制含20 g·L-1核糖酸内酯与10 g·L-1山梨醇的分析保护溶液。精密量取质量浓度为1 mg·L-1的磷酸三苯酯内标贮备液加入分析保护溶液制成50 μg·L-1内标分析保护剂溶液。

2.2.2 标准溶液的配制 精密量取农药标准品混合对照品贮备溶液适量，稀释成1、2、5、10、20、40、50、100、200 ng·mL-1不同浓度系列的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取藤茶粉末(过二号筛)5 g，精密称定，置 50 mL 聚苯乙烯具塞离心管中，加氯化钠 1 g，加乙腈匀浆2次(30 mL/次)，离心15 min (8 000 r·min-1)，分取上清液，合并两次上清液，减压浓缩至约5 mL，放冷，离心、滤过，转移至串联HLB萃取柱，加乙腈 25 mL 洗脱，收集洗脱液，浓缩，加适量乙腈复溶、浓缩，直至无白色粉末析出，用乙腈转移并定容至2 mL，0.22 μm膜滤过，即得。

2.2.4 测定法 精密量取混合对照品溶液、供试品溶液各1 mL，加GC-MS/MS分析用内标-分析保护剂0.3 mL，混匀，分别精密吸取1 μL，注入气相色谱串联质谱仪，测定，即得。

2.3 结果

2.3.1 线性关系考察 吸取各浓度标准品按“2.2.4”项下方法测定，计算以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程。结果显示在51种农药测定的相关系数r均>0.990，见表3，表明各农药线性关系良好。

2.3.2 灵敏度 按“2.2.4”项下方法测定，以检出限(LOD)按3倍的信噪比(S/N)计，定量限(LOQ)按 10 倍的信噪比(S/N)计，以添加最低质量分数点10 mg·kg的响应值与空白样品测出的信号进行计算，本方法的LOD范围为0.001～0.01 μg·kg-1，LOQ范围为0.002～0.02 μg·kg-1。

2.3.3 回收率 精密称取已知各残留农药含量的藤茶样品5 g，分别加入20、50、100 ng·mL-1浓度水平的对照品溶液，平行制备3份样品测定，计算回收率，平均回收率在62.2%～121.6%之间。

2.3.4 基质效应 同时选取两组分别由溶剂和空白基质溶液配制的混合标准工作溶液，以峰面积对各个农残的质量浓度作线性回归，绘制标准曲线。采用式(1)：ME(%)=Ais·Ai(1)对基质效应进评估，结果见表2。式中，Ais为空白提取液系列标准曲线的斜率；Ai为50%甲醇系列标准曲线的斜率。

2.3.5 测定结果 72批藤茶药材中17批检出1～3种农药，检出率为23.6%。检出指标有哒螨酮、喹螨醚和苯醚甲环唑，根据《GB2763-2019食品安全国家标准茶叶中最大农药残留限量标准》中茶叶农药最大残留限量规定：哒螨酮5 mg·kg-1、喹螨醚15 mg·kg-1、苯醚甲环唑10 mg·kg-1，所有批次3种农药残留均低于标准规定的最大残留限度。

表2 51种农药及内标的保留时间及质谱分析参数、相关系数、方法检出限、定量限及回收率

表3 藤茶中农药残留测定结果

3 讨论

3.1 农药指标的遴选

以上指标遴选自《GB2763-2019食品安全国家标准食品中农药最大残留限量标准》中茶叶的农药残留标准，结合2015年版《中国药典》第4部农药残留量检测、《香港中药材标准》[5]对中药材农药残留的要求，选择了包括有机氯、有机磷、拟除虫菊酯等常用、剧毒、农民易获得并滥用的51种农药指标，进行实验研究，以上指标检测结果比较全面地反映了藤茶的农药残留现状。

3.2 提取、净化与基质效应考察

51种农药指标化学性质差异较大，且藤茶中含有丰富的黄酮类、多糖类和多酚类化合物，为了达到同时检测，故对提取和净化提出了较高要求。本研究比较了丙酮、乙腈、乙酸乙酯3种，用丙酮和乙酸乙酯提取时提取出来的杂质较多，颜色较深；丙酮提取回收率较乙酸乙酯和乙腈低。乙腈适合的农药极性范围较广，提取效果好，针对藤茶避免提取更多色素，故选用乙腈作为提取溶剂。

藤茶中有含量高达40%的二氢杨梅素，易溶于乙腈。低温易析出[6]，为降低二氢杨梅素的干扰，在固相萃取前后浓缩，冷贮，滤过，直至无白色粉末析出，再进行后续的测定，该操作简单，净化回收率有保障。

固相萃取净化方法是复杂基质中痕量检测进行净化的常用方法。本试验用HLB、C18、NH2-C18及QuEChERS等常用净化方法，比较基质效应由大到小依次为：QuEChERS、C18、NH2-C18、HLB，因此考虑用waters Oasis型固相萃取小柱进行净化。由于藤茶叶绿素等杂质丰富，采用HLB·HLB串联萃取净化，颜色深浅浅，基质效应不明显(±30%)。

3.3 结果分析及种植建议

检出农药为哒螨酮、喹螨醚和苯醚甲环唑，其中哒螨酮为中毒广谱、触杀性杀螨杀虫剂，用于棉花、柑橘、果树等经济作物上防治螨类害虫；喹螨醚为近年推出的新型低毒的喹唑啉类杀螨剂，用于水果和观赏植物上，可有效防治螨虫病；苯醚甲环唑是安全性比较高的三唑类杀菌剂，广泛应用于谷物、果树、蔬菜等作物[7-9]。

实验结果分析发现以上3种农药均不适用于藤茶病虫害的防治，且实地农药使用情况调研证实在藤茶种植过程中，均应按照绿色食品种植技术，采取选择适合本地区生长的藤茶品种，増施磷、钾肥，合理密植，多雨季节及时排水，降低土壤湿度，适时修剪清除枯枝败叶以及及时清除病叶等农业综合防治法措施进行病虫害防治[10-12]。而检出农药的样品均为栽培品，来自湖北来凤、江西大余，野生品中未检出农药残留。通过再次走访产地，了解到来凤县的藤茶基地前作植物为百合和水稻，大余县周边种植脐橙，需要飞机喷施农药，因此土壤中农药残留和周边作物喷施农药导致藤茶叶表面少量吸附。为了保证藤茶的安全性，提示藤茶种植要考虑环境农药残留以及前作植物、周边作物施洒农药的间接污染，从源头避免农药污染，保证中药材的安全。