高效液相色谱法测定饲料中的单宁酸

常选妞，杨新玲，杨建平

(1.河南牧业经济学院河南省非常规饲料资源创新利用重点实验室，河南 郑州 450046；2河南牧业经济学院理学院，河南 郑州 450046；3.河南牧业经济学院河南省高校饲料工程技术研究中心，河南 郑州 450046)

0 引言

单宁酸是由五倍子提取得到的一种鞣酸，单宁酸结构中含有多酚基团，有很强的生理活性功能，单宁酸的抗菌、消炎、促生长和防治肠道腹泻，抑制大肠杆菌、轮状病毒的作用在动物营养界被广泛关注「1」。关于单宁酸的测定标准有LY/T 1642-2005《单宁酸分析试验方法》「2」和GB/T 27985-2011《饲料中单宁的测定分光光度法》「3」，这两个标准针对测定高含量的单宁酸原料，且操作繁琐、耗时、所用试剂多。而对基质复杂的常规配合饲料、浓缩饲料、混合型饲料添加剂中低含量的单宁酸的检测方法尚未有报道。本研究建立以高效液相色谱测定饲料中单宁酸方法，方法简便、快捷、准确，适合饲料企业作为质量控制的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱仪；W2487双通道紫外可见检测器；甲醇(色谱纯，Fisher)；乙腈(色谱纯，Fisher)；单宁酸标准品(含量≥95.2%)。

单宁酸标准溶液：准确称取单宁酸标准品25 mg(精确至0.1 mg)，置于100 mL容量瓶中，用水溶解，定容至刻度，摇匀。该储备液的浓度为250 μg/mL。

单宁酸标准工作液：准确移取不同体积的储备液，用水配制成不同浓度的标准工作液。

1.2 样品前处理

称取配合饲料样品5.0 g，浓缩饲料3.0～5.0 g，预混料1.0 g置于50 mL离心管中，加入20%甲醇溶液25.00 mL，涡旋15 min，8 000 r/min 离心5 min，取出上清液，残渣用20%甲醇溶液25.00 mL重新提取1次。合并2次提取液，混匀，精密移取提取液适量，50℃氮吹干，加5.00 mL 20%甲醇溶液复溶，取上清液过0.45 μm滤膜，上机测定。

1.3 色谱条件

色谱柱为WatersXB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇：0.1%磷酸水溶液=20:80，流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：275 nm。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

单宁酸分子有较强的极性，极易溶于水和一些有机溶剂中如甲醇、乙腈、乙酸、乙酸乙酯等，而在三氯甲烷、正己烷中均不溶。故选择水、甲醇、乙腈作为提取溶剂反复试验，试验结果发现，用水提取溶剂，回收率低，考虑单宁酸易被氧化，商品用单宁酸做成包被产品，不容易提取出来。甲醇作为提取溶剂，回收率高，但提取液里杂质多，基质干扰。用乙腈作为提取溶剂，回收率高，基质干扰小，故选择乙腈作为提取溶剂。

2.2 检测波长的选择

取单宁酸适量，用20%甲醇溶液配成单宁酸浓度为10 μg/mL的溶液，用紫外-可见分光光度计在200～400 nm扫描。结果表明，单宁酸在275nm处有最大吸收，因此，波长选择275 nm。

2.3 流动相的筛选与优化

单宁酸结构中有多酚羟基和羧基，极性强、在C18柱上几乎无保留，水中含有一定量的磷酸能增加保留时间，同时还能抑制单宁酸氧化和离子化，减少拖尾。采用梯度洗脱，单宁酸峰型完好，无杂质干扰，分离色谱图如图1、图2所示。

图1 单宁酸标准图谱

图2 样品图谱

2.4 线性范围

将标准溶液逐级稀释成0.5、2、5、10、15、20、30、50 μg/mL的浓度，以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，得回归方程 Y=7 313.47X+7 075.82，R2=0.999 5，显示在0.5～50 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.5 检出限定量限

分别以S/N=3和S/N=10确定检出限和定量限。配合饲料、浓缩饲料的检出限为0.2 mg/kg，定量限为0.5 mg/kg。预混料的检出限为0.5 mg/kg，定量限为1.0 mg/kg。

2.6 准确度与精密度

以阴性饲料样品作为空白样品，进行50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg 3种水平的加标回收试验，平均回收率为99.7%，单宁酸的相对标准偏差(RSD)为0.7%～1.2%，符合方法学要求，说明该方法精密度好，准确可靠。

3 结语

建立了饲料中单宁酸测定的高效液相色谱法，本方法具有操作简单、快速、准确，仪器设备要求不高，适合饲料企业质量控制使用。