白鲜皮多糖纯化、结构表征以及抗过敏研究

刘 冬，韩吉欣，张 云1,，刘 娟，向育铭，曹玉华

1绿叶日用品有限公司，苏州 215151；2江南大学化学与材料工程学院，无锡214122

白鲜皮为芸香科植物白鲜(DictamnusdasycarpusTurcz.)的干燥根皮，含多糖、黄酮、生物碱、甾体类化合物等成分，具有清热燥湿、湿热疮毒、祛风解毒等功效，可用于治疗足癣、荨麻疹、皮肤疹痒、湿疹等皮肤病，具有较强的抗过敏及止痒作用[1]。中草药中提取的多糖种类繁多，结构复杂，且很大一部分具有促进免疫调节、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性[2-4]。

化妆品引起的皮肤过敏是近年来消费者主要关心的安全性问题[5]。引起皮肤过敏的主要原因是IgE介导的I型超敏反应，经过过敏源致敏、肥大细胞激活脱粒、免疫细胞应答等一系列复杂过程，最终导致过敏反应的发生[6]。肥大细胞是过敏反应中的效应细胞，在过敏性皮肤病以及炎症过程中发挥着重要作用[7]。皮肤过敏还与皮肤的屏障功能、神经因素以及炎症反应有着密不可分的联系[8]。

大鼠嗜碱性白血病粒细胞RBL-2H3(rat basophilic leukemia cells，RBL-2H3)是大鼠嗜碱性粒细胞肿瘤株的一个亚系，细胞表面富含大量IgE高亲和力受体，具有肥大细胞的多种生物学特性，是公认的能够传代培养的肥大细胞体外替代模型。β-氨基己糖甘氨酶(β-HEX)是肥大细胞的标志性颗粒，也是肥大细胞脱颗粒研究中的主要的介质[9,10]，肥大细胞在被人工合成的多胺类化合物刺激剂C48/80(Compound 48/80)[11]刺激后会脱颗粒，在此期间β-HEX的释放水平与肥大细胞脱颗粒的程度一致，与组胺释放呈正相关，因此其常检测作为肥大细胞脱颗粒的指标[12-15]。细胞膜是皮肤屏障作用的重要部分，改进后的红细胞(red blood cell,RBC)溶血实验可以通过红细胞中漏出的血红蛋白的量来判断抗敏活性物质对细胞膜的保护功能[8,16,17]。另外人体内的自由基会攻击细胞膜和蛋白质从而导致细胞衰老死亡，抑制自由基的活性可有效缓解由自由基引起的细胞老化，维护皮肤屏障作用[18]。

Zhao等[19]发现白鲜皮粗提物抑制C48/80诱导肥大细胞脱颗粒，减少组胺及β-HEX释放，具有抗敏功效；Zhang等[20]分离出一种纯净的白鲜皮多糖，并在硫酸酯化修饰后验证其具有抗银屑病的功效；Shi等[21]通过小鼠耳廓肿胀实验和小鼠毛细血管渗透性实验验证了其抗炎活性；Cong等[22]验证了白鲜皮水提物可抑制DNCB诱导的小鼠迟发型变态反应(DTH)，且具有抑制小鼠特异性细胞免疫的功能。截止到目前，对于白鲜皮粗提物的抗敏作用虽然有过一些研究进展，但还未有研究验证白鲜皮水提物中的主要成分——白鲜皮多糖的抗敏功效。所以本实验对白鲜皮多糖进行提取分离，并对其成分进行了理化分析；以抗敏功效为研究目的进行了抑制RBL-2H3肥大细胞脱颗粒实验等检测分析，为研究白鲜皮多糖作为抗敏物质提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

白鲜皮(北京同仁堂，批号202009)；填料DEAE Fast Flow(博格隆生物技术有限公司，编号A10032)；木瓜蛋白酶(上海蓝季科技发展有限公司，批号131025)；RBL-2H3细胞(北纳创联生物技术研究院，批号100222)；MEN-EBSS培养基(Hyclone，批号AF29496678)；胎牛血清(gibco，批号FBS-PA011019)；PBS缓冲溶液(Cytiva，批号AF29561133)；Compound 48/80(Sigma，批号0000101308)；对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(Sigma，批号SLBR7548V)；新鲜兔血(江南大学实验动物中心)；十二烷基磺酸钠SDS(国药集团化学试剂有限公司，批号20171116)；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Waters 1525EF高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；ICS5000离子色谱仪(美国戴安公司)；Nicolet 6700全反射傅里叶红外光谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)；全波长酶标仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)

1.3 实验方法

1.3.1 白鲜皮多糖的提取、分离、纯化

取白鲜皮50 g，研磨，过20目筛后石油醚超声30 min去脂。待石油醚自然挥发后将粉末浸泡于60%乙醇溶液中过夜，采取料液比1∶15于95 ℃冷凝回流2 h，过滤，重复以上步骤2次，合并滤液，减压浓缩。在浓缩液中分三次加入蒸馏水100 mL，离心抽滤，加入5倍体积乙醇醇沉。沉淀复溶于去离子水中，按1.5 g/L的比例加入木瓜蛋白酶，60 ℃水浴2 h后，于95 ℃下灭酶活30 min，然后用Savage法去蛋白，其中V(氯仿)∶V(正丁醇)= 4∶1，V(Savage试剂)∶V(样液)= 5∶1，充分振荡后离心，小心取上清液，重复操作直至中间无蛋白层出现。再次加入5倍体积乙醇醇沉，沉淀依次用丙酮和无水乙醇洗涤2次，复溶于去离子水中，透析一周，冻干得白鲜皮多糖(Cortex Dictamni polysaccharides，CDPS)

称取50 mg CDPS，溶于10 mL去离子水中，过0.45 μm滤膜后经DEAE Fast Flow(50 cm×1 cm)离子交换柱纯化，超纯水洗脱，每管收集5 mL洗脱液，并利用苯酚硫酸法测定每管的吸光度A490，绘制洗脱曲线。收集主要洗脱组分，冻干得白鲜皮多糖CDPS-1和CDPS-2。

1.3.2 白鲜皮多糖的总糖和蛋白含量测定

分别利用苯酚硫酸法[23]和考马斯亮蓝G-250法[24]测定总糖和蛋白含量。得率按公式(1)计算，总糖和蛋白含量按公式(2)计算：

白鲜皮多糖=m1/m2×100%

(1)

式中：m1：提取液中总糖质量或CDPS-1、CDPS-2的质量(g)；m2：白鲜皮的质量(g)。

总糖或总蛋白含量=m1/m2×100%

(2)

式中：m1：测定的CDPS、CDPS-1、CDPS-2中的总糖或蛋白的质量(g)；m2：CDPS、CDPS-1、CDPS-2的质量(g)。

1.3.3 白鲜皮多糖的相对分子量和单糖组成分析

利用高效凝胶过滤色谱(high performance size exclusion chromatography，HPGFC)法测定白鲜皮多糖样品的分子量，由葡聚糖标准品(Mw：0.18、2.7、9.75、13.5、30和200 kDa)得到标准曲线。色谱条件如下：Waters 1525EF高效液相色谱仪；2 410示差折光检测器；Empower工作站；UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mm色谱柱；流动相0.1 mol/L NaNO3水溶液；流速0.8 mL/min；柱温40 ℃；进样量50 μL。

称取5 mg白鲜皮多糖样品，分别加入2 mol/L三氟乙酸300 μL，100 ℃下降解12 h，氮气吹干，加入200 μL甲醇，吹干，重复操作3次以除去三氟乙酸，然后定容至25 mL。使用离子色谱仪(脉冲安培检测器)进行色谱分析，色谱条件如下：赛默飞戴安ICS-5000+高压离子色谱仪(采用Dionex CarboTMPA20 3×150 mm色谱柱，柱温30 ℃，流速：0.5 mL/min，进样量：20 μL)洗脱程序如表1所示。分别配制单糖混合标准溶液1 mg/mL(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)，按照上述离子色谱方法进行色谱分析，根据标准品的保留时间和峰面积，可以确定多糖样品中的单糖组成和摩尔百分比。

表1 离子色谱洗脱程序Table 1 The elution program of ion chromatography

1.3.4 白鲜皮多糖的FT-IR分析

取干燥的白鲜皮多糖样品1～2 mg，在600～4 000 cm-1内进行全反射傅里叶红外检测。

1.3.5 RBL-2H3细胞培养

取RBL-2H3细胞(购于北纳创联生物技术研究院)，37 ℃解冻，将其完全置于培养基中(含10%胎牛血清的MEN-EBSS)，37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，每2天进行一次传代。

1.3.6 RBL-2H3细胞活性的检测

采用CCK-8细胞活力检测试剂盒检测。取出处于对数生长周期的RBL-2H3细胞，消化制备成细胞悬液，用完全培养基将细胞浓度调整至2.0×105

个/mL，每孔100 μL加入到96孔板中，37 ℃、5% CO2的培养箱中贴壁12 h。弃上清，分别加入用MEM-EBSS培养基稀释的不同浓度的CDPS样品100 μL(10、5、1、0.5、0.1 mg/mL)，每组设置3复孔。设置对照组(不加入CDPS的细胞孔)和空白组(不接种细胞的空白组)。37 ℃，5% CO2的培养箱中培养24 h后各孔中加入含10%的CCK-8培养基溶液100 μL(上海碧云天生物技术有限公司)，恒温箱避光孵育2 h，经轻微震荡，于酶标仪检测波长450 nm测定各孔OD值。细胞活性通过公式(3)计算得到。

细胞活性=

(ODCDPS-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100%

(3)

1.3.7 RBL-2H3细胞活化脱颗粒β-HEX的检测

取出处于对数生长周期的RBL-2H3细胞，消化制备成细胞悬液，用完全培养基将细胞浓度调整至2.0×105个/mL，接种至24孔板中，每孔1 000 μL，置于培养箱培养12 h后，弃上清，PBS缓冲液清洗两次。分别加入用MEM-EBSS培养基稀释的不同浓度的CDPS样品1 000 μL(10、5、1、0.5、0.1 mg/mL)，同时设置3个复孔，并命名为给药组；设置对照组和空白组(不加入CDPS样品的细胞孔)。37 ℃，5% CO2培养箱中孵育2 h。弃上清，PBS缓冲液清洗两次，给药组及模型组每孔加入1 000 μL浓度为100 μL/mL的Compound 48/80培养基溶液，空白组用等量培养基替代，置于培养箱中孵育40 min后，冰水浴10 min。收集各组上清液，每孔取50 μL加入96孔板，加入50 μL显色液(含1 mmol/L对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液)，37 ℃孵育1 h后，加入200 μL终止液(Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液)终止反应，于酶标仪检测波长405 nm下测定各孔OD值。通过公式(4)计算得到β-HEX释放抑制率。

β-HEX释放抑制率=

[1-(OD给药-OD空白)/(OD对照-OD空白)]×100%

(4)

1.3.8 RBC溶血实验

采集新鲜兔血，用PBS多次混洗离心去上清后，将沉淀部分稀释至50%，用含0.1% SDS的PBS溶液将其稀释至不同浓度(0.5%～5%)，室温下180 rpm摇床孵育10 min，11 180 g离心1 min，取出200 μL上清液于530 nm处检测OD值。选择OD值在2～2.5范围内的RBC浓度，分别加入不同浓度SDS的PBS溶液(0.01%～0.1%)，设置阳性对照组和阴性对照组，重复上述步骤，检测SDS浓度对细胞溶血的影响。溶血率计通过公式(5)计算得到。

溶血率=(OD实验-OD阴性对照)/

(OD阳性对照-OD阴性对照)×100%

(5)

选取溶血率50%～70%范围内SDS刺激浓度，OD值在2～2.5范围内的RBC浓度，加入不同浓度CDPS样品溶液(10～0.1 mg/mL)，设置阳性对照组和阴性对照组，重复上述步骤，测定样品于SDS共同作用后的红细胞溶血率。红细胞的抑制率通过公式(6)计算得到。

抑制率=(1-CDPS保护溶血率/

实验浓度SDS刺激溶血率)×100%

(6)

1.3.9 DPPH清除实验

配置不同浓度的CDPS样品水溶液和维生素C溶液(0.1～10 mg/mL)，将100 μL样品溶液加入96孔板中，加入0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液100 μL，同时设置3个复孔，命名为给药组；设置对照组和空白组，对照组加入100 μL水+100 μL DPPH乙醇溶液，空白加入100 μL的样品溶液+100 μL的无水乙醇，同时设置3个复孔；室温避光显色30 min，517 nm处检测OD值。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 白鲜皮多糖纯化和结构表征

2.1.1 白鲜皮多糖的分离

白鲜皮多糖CDPS经过离子交换层析(DEAE Fast Flow)用水和0.1 mol/L的氯化钠洗脱，洗脱曲线见图1，洗脱后得两个吸光度值较高的洗脱峰，分别命名为CDPS-1和CDPS-2，冻干备用。

图1 DEAE Fast Flow色谱柱洗脱曲线Fig.1 Elution curve of DEAE Fast Flow column

2.1.2 白鲜皮多糖的总糖和总蛋白含量测定

根据苯酚硫酸法和考马斯亮蓝G-250法分别测得CDPS、CDPS-1、CDPS-2的总糖和总蛋白含量。结果如表2所示，CDPS和CDPS-1的总糖含量超过99%，蛋白含量均低于0.05%；CDPS-2得率低于0.05%。

表2 白鲜皮多糖的得率、总糖和蛋白含量Table 2 Yield,total sugar and protein content of CDPS

2.1.3 白鲜皮多糖CDPS-1的分子质量和单糖组成分析

对含量较高的CDPS-1进行了表征。HPGFC测定结果如图2和表3所示，色谱图出现一个单峰，确认CDPS-1为单一组分，分子量为2 577 Da。单糖组成的结果如表4所示，CDPS-1主要由岩藻糖，葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖组成，摩尔比为0.41∶1.38∶3.15∶15.4∶79.61。

表3 CDPS-1的HPGFC测定结果Table 3 HPGFC determination of CDPS-1

表4 CDPS-1单糖组成离子色谱分析结果Table 4 Analysis of monosaccharide composition of CDPS-1 with ion chromatography

图2 CDPS-1的HPGFC色谱图Fig.2 HPGFC chromatogram of CDPS-1

2.1.4 白鲜皮多糖的FT-IR分析

由图3可知，CDPS-1在3 313 cm-1处的吸收峰属于-OH的伸缩振动，在2 925 cm-1处的吸收峰是C-H的伸缩振动，1 639 cm-1的吸收峰归因于羧基的C=O键的振动，1 410和1 341 cm-1的吸收峰属于δ-CH2的弯曲振动，1 147和1 076 cm-1的吸收峰归>因于C-O-C和C-O的伸缩振动，1 011 cm-1的吸收峰表明存在吡喃糖环，922和846 cm-1的吸收峰属于α型糖苷键，上述特征表明CDPS-1是以α型糖苷键为主的多糖化合物。

图3 CDPS-1的红外光谱图Fig.3 Infrared spectrum of CDPS-1

2.2 白鲜皮多糖抗过敏性能研究

2.2.1 CDPS对RBL-2H3细胞脱颗粒释放β-HEX的抑制作用

2.2.1.1 细胞活性检测

CDPS对RBL-2H3细胞活性的影响如图4所示，RBL-2H3细胞与浓度范围在0.1～10 mg/mL的CDPS共培养24 h后，细胞活性均高于95%，证明在此浓度范围内CDPS样品对细胞无毒性影响，可用于后续实验中。

图4 CDPS对RBL-2H3细胞存活率的影响Fig.4 Effect of CDPS on cell viability of RBL-2H3

2.2.1.2 CDPS对RBL-2H3细胞脱颗粒释放β-HEX的抑制作用

肥大细胞是I型变态反应炎症反应的核心效应细胞。RBL-2H3具有与肥大细胞相似的细胞结构，细胞表面具有和肥大细胞相同的高亲和力FcεR I受体，并且其能模拟肥大细胞的多种功能(如脱颗粒)，且具有可传代培养和性状稳定等优点，是研究与肥大细胞相关的生理、病理和药物作用机制的理想替代模型。β-HEX是RBL-2H3细胞脱颗粒的主

要研究介质。当RBL-2H3细胞受到刺激后脱颗粒释放的β-HEX会分解对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷，在405 nm处出现吸光度峰值，以此来监测β-HEX的释放率。在CDPS与RBL-2H3细胞共培养后刺激脱粒，计算可得CDPS对RBL-2H3细胞脱颗粒释放β-HEX的抑制作用，如图5所示，CDPS样品在0.1～10 mg/mL的浓度范围内对β-HEX的释放均有抑制作用；在0.1～1.0 mg/mL的浓度范围内，抑制率呈上升趋势；在1～10 mg/mL的浓度范围内，抑制率呈下降趋势；在1 mg/mL的浓度下抑制率达到峰值，为15.54%。CDPS-1在0.1～1.0 mg/mL的浓度范围内对β-HEX的释放均有抑制作用，且抑制率呈上升趋势；在1 mg/mL的浓度下抑制率达到28.54%，约为CDPS的两倍。实验证明CDPS和CDPS-1均有良好的抗敏效果，且在1 mg/mL的给药浓度下抑制率达到峰值。

图5 CDPS和CDPS-1对刺激剂诱导 RBL-2H3细胞释放β-HEX的影响Fig.5 Effects of CDPS and CDPS-1 on the release of β-HEX in RBL-2H3 cells induced by stimulants

2.2.2 白鲜皮多糖抑制红细胞溶血

2.2.2.1 不同浓度白鲜皮多糖CDPS的红细胞溶血率

白鲜皮样品CDPS对RBC毒性可通过溶血率进行判断，实验结果如图6所示。实验结果可以看出，白鲜皮样品CDPS在0.1～10 mg/mL范围内几乎没有溶血(<2%)，即对细胞膜没有损伤。

图6 CDPS的RBC溶血率比较Fig.6 Comparison of RBC hemolysis rate of CDPS

2.2.2.2 不同浓度刺激物作用下红细胞溶血效果

SDS是RBC溶血实验的阳性对照物，通常实验浓度为0.2%，即0.2% SDS可以达到100%的RBC溶血率。通过测定0.2%以下不同浓度梯度的SDS的RBC溶血率，筛选出特定细胞溶血率的SDS浓度，进行RBC溶血抑制实验。实验结果如图7所示，在0.01%～0.04%浓度范围内，RBC溶血率逐渐提升，在0.05%～0.2%浓度范围内，RBC溶血率达到90%以上。拟选取0.02%SDS作为实验浓度，此时RBC溶血率为55.42%。

图7 SDS的RBC溶血率Fig.7 The hemolysis rate of red blood cells by different concentration of SDS

2.2.2.3 白鲜皮多糖红细胞溶血抑制性能

在RBC中先加入不同浓度的CDPS，再加入浓度为0.02%的SDS，测定溶血率，与未经CDPS处理直接加入SDS的RBC溶血率比较，即可评价CDPS是否具有保护细胞膜，使之免受刺激物损伤的作用。实验结果如图8所示，在CDPS给药浓度在0.1～5 mg/mL范围内，RBC溶血率逐渐降低，溶血抑制率逐渐升高；在5～10 mg/mL范围内，RBC溶血率逐渐升高，溶血抑制率逐渐降低；在5 mg/mL时达到最优值，溶血率为17.54%，溶血抑制率为62%。由此可见，CDPS对细胞膜有良好的保护作用，且在浓度为5 mg/mL的浓度下，RBC溶血抑制率超过60%，具有较好的抗SDS刺激效果。

图8 CDPS与SDS共同作用后红细胞的溶血率和抑制率Fig.8 The hemolysis rate and hemolytic inhibition rate of RBC treated with CDPS and SDS

2.2.3 白鲜皮多糖抗氧化性

白鲜皮多糖CDPS的DPPH清除率如图9所示，在0.1～1 mg/mL的浓度范围内，CDPS浓度对DPPH清除率没有显著变化；在1～10 mg/mL的浓度范围内，随着CDPS浓度的升高，对DPPH的清除率呈缓慢上升趋势。在浓度为10 mg/mL的条件下DPPH清除率超过40%，说明白鲜皮多糖CDPS有一定的抗氧化作用。

图9 CDPS的DPPH自由基清除率Fig.9 DPPH radical scavenging rate of CDPS

3 结论

本研究对白鲜皮进行提取分离，获得白鲜皮多糖CDPS，并对其进行进一步纯化获得白鲜皮多糖CDPS-1。利用GFC、IC和FT-IR等方法对CDPS-1进行表征，CDPS-1主要以α型糖苷键为主，分子量为2 577 Da，主要由岩藻糖，葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖组成，摩尔比为0.41∶1.38∶3.15∶15.4∶79.61。测定了CDPS对RBL-2H3细胞脱颗粒释放β-HEX的抑制率、RBC溶血抑制率和DPPH清除率，结果显示在0.5～1.0 mg/mL的浓度范围内CDPS对β-HEX的释放抑制率和RBC细胞膜保护效果较好，峰值分别达到了28.54%和62.1%，且对DPPH有超过25%的清除率。本实验提取的白鲜皮多糖有良好的抗敏功效，推测其对细胞膜的保护能力和抗氧化能力为抗敏机制起到一定的作用。