日本结缕草ZjNAC3基因在盐胁迫中的功能

姜红岩，范希峰，温海峰，韩 朝，滕文军，滕 珂，尹淑霞

（1.北京市农林科学院，北京 100097；2.北京林业大学草业与草原学院，北京 100083）

土壤盐碱化是影响植物生长的主要非生物胁迫，严重影响作物产量[1]。盐胁迫会使植物产生离子毒害作用，影响植物吸收水分，破坏生理机制导致植物枯萎死亡[1-2]。草坪草生长容易受到外界环境的影响，坪观质量在园林绿化、运动场应用中是一项重要的衡量标准。盐胁迫影响草坪草种子的萌发，草坪草的生长发育、营养物质积累及抗氧化酶的活性，从而影响草坪的使用价值[3-4]。

转录因子在植物的生长发育、抵抗环境胁迫中发挥着重要作用[5]。已有研究证明，转录因子能够通过调控上下游基因影响植物对盐胁迫的耐受性，其中包括AP2/ERF、NAC、WRKY、MYC 等转录因子家族[5]。NAC 转录因子在模式植物中被率先得以研究，发现其在盐胁迫响应中发挥着重要作用[6]。NAC 转录因子家族成员在调控盐胁迫中具有不同的功能，有些NAC 转录因子在植物的抗盐性方面起负调控作用，而另一些成员发挥着正调控的作用。如NAC 转录因子NTL8能够通过赤霉素(gibberellin acid，GA)信号传导途径负调节种子的发芽[7]；过表达ANAC092基因能降低盐胁迫下种子的发芽能力[8]。而PvNAC1[9]、SNAC1[10]、ONAC045[11]、OsNAC2[12]、OsNAC6[13]等转录因子能够增强植物的耐盐性。

结缕草(Zoysia japonica)是我国一种重要的乡土草坪草，具有抗逆性强、养护成本低等优点[14]。在结缕草中鲜有NAC 转录因子对植物的耐盐性影响的报道，之前研究表明日本结缕草中的ZjNAC2基因能够受到300 mmol·L−1NaCl 的诱导表达[15]，而NAC 转录因子在结缕草适应盐胁迫中的作用尚不清楚。本研究通过获得转ZjNAC3基因的酵母菌株和拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株，并对其进行盐胁迫处理，旨在探究日本结缕草NAC 转录因子ZjNAC3 在盐胁迫下的调控作用，以期为深入研究NAC 转录因子调控日本结缕草耐盐性及其机理奠定前期工作基础。

1 材料与方法

1.1 材料

农杆菌GV3101、拟南芥种子、pYES2 载体、YPH500 酵母菌株均为北京市农林科学院草业花卉与景观生态研究所实验室保存；Ura 培养基购自北京泛基诺公司；氯化钠等分析纯试剂购自北京科百奥公司；RNA 试剂盒购自OMEGA 公司；SYBR Premix购自TaKaRa 公司。本试验所用拟南芥植株在江南人工气候培养箱中培养，培养条件为24 ℃/22 ℃ (日/夜)，16 h 光照，湿度65%。

1.2 方法

1.2.1 酵母转化及转基因酵母的盐胁迫处理

以pYES2-ZjNAC3-F/R 为 引 物(表1)，pMD19-ZjNAC3 克隆载体为模板扩增，将扩增产物连接到pYES2 载体上构建重组质粒pYES2-ZjNAC3。按照Clontech 的说明书(货号： 630439) 转化酵母，分别将构建的pYES2-ZjNAC3 和pYES2 空载质粒转化YPH500 酵母菌株。挑取SD/-Ura 培养基平板上生长的单菌落于Ura 液体培养基中培养至OD600值为0.2，以pYES2-F/R (表1)为引物进行菌落PCR 鉴定后，按照 1 ꞉ 10、1 ꞉ 100、1 ꞉ 1 000、1 ꞉ 10 000 的比例进行稀释。将稀释后的菌液接种到含有0、200、300 mmol·L−1NaCl 的Ura 固体培养基上培养2～3 d，观察酵母菌落的生长情况。

1.2.2 拟南芥转基因

以3302Y3-ZjNAC3-F/R 为引物(表1)，以pMD19-ZjNAC3 克隆载体为模板进行PCR 扩增，将扩增产物连接到3302Y3 载体[15]上，构建3302Y3-ZjNAC3。取5 μL 构建好的质粒于50 μL 农杆菌感受态中，冰浴30 min，液氮中速冻1 min，37 ℃下水浴5 min，冰浴5 min，之后28 ℃暗培养4 h 后涂布于培养基上培养，2～3 d 后挑取单克隆进行PCR 鉴定。对鉴定正确的菌液用50%甘油进行保菌，于−80 ℃冰箱保存以备用。然后用获得的转化目的质粒的GV3101农杆菌菌液浸染拟南芥花序，选择生长3～4 周大小的拟南芥植株，将其花序浸到农杆菌菌液中，浸染时间不超过30 s，暗培养12 h 后恢复正常的光照条件。待植株生长成熟后收获的种子备用。

表1 引物列表Table 1 List of primers used in this study

1.2.3 转基因植株的鉴定

将收获的T0代拟南芥种子放于冰箱中4 ℃下春化2～3 d，播种于草炭 ꞉ 蛭石 ꞉ 珍珠岩配比为3 ꞉ 1 ꞉ 1的基质中。播种后1～2 周，对幼苗喷施60 mg·L−1的草铵膦溶液一次进行初步筛选。存活下来的拟南芥植株生长至3～4 周后，用CTAB 法提取叶片DNA，并以3302Y3-F/R (表1) 为引物进行转基因植株鉴定。扩增产物经凝胶电泳检测后，选择条带大小符合的拟南芥植株继续收获种子，直至筛选至T3代后用于后续试验。

1.2.4 对转基因拟南芥植株的盐胁迫处理

选用稳定遗传的T3代转基因拟南芥种子，先用1%次氯酸钠溶液消毒5 min，70%酒精消毒30 s，无菌水清洗4～5 次，然后播种在MS 培养基上，生长3 周后转移到基质中生长。待植株生长1 个月时，提取整株转基因拟南芥的RNA，以ZjNAC3-F/R 为引物(表1)对ZjNAC3进行表达量分析。选择ZjNAC3基因表达量相对较高的株系和野生型(WT)进行盐胁迫处理，每个株系设置4 个重复。每盆第1 天浇灌50 mL 50 mmol·L−1的NaCl，第2天浇灌50 mL 100 mmol·L−1NaCl，第3 天浇灌50 mL 150 mmol·L−1NaCl，对照浇灌相同量的蒸馏水，处理7 d后拍照并剪取叶片测定相关指标。

采用蒽酮显色法[16]、茚三酮比色法[16]、浸提法[17]、硫代巴比妥酸(TBA)比色法[18]分别测定可溶性糖、脯氨酸、叶绿素、丙二醛含量，同时参照陈爱葵等[19]的方法测定细胞膜透性。利用RNA 试剂盒提取RNA，反转录为cDNA。通过qRT-PCR 技术，以AtUBQ 为内参，参照Teng 等[14]设 计AtNHX1、AtAPX1、AtPOD 和AtUBQ 引 物(表1)，采 用2−ΔΔCT法测定AtNHX1、AtAPX1、AtPOD基因的表达情况。

2 结果与分析

2.1 ZjNAC3 基因对盐胁迫下酵母菌株生长的影响

本研究成功构建了载体pYES2-ZjNAC3 (图1)，同时将pYES2-ZjNAC3 载体转到酵母YPH500 菌株中进行盐敏感性测定(图2)。

图1 pYES2-ZjNAC3 载体构建的PCR 检测Figure 1 PCR verification of the constructed pYES2-ZjNAC3 vector

图2 ZjNAC3 对转基因酵母的影响Figure 2 Effect of ZjNAC3 on the growth of transgenic yeast cells under salt stress

结果表明，在Ura 固体培养基上转空载与重组质粒pYES2-ZjNAC3 的酵母菌株在相同的培养时间内长势基本一致。而在盐胁迫下，含有重组质粒的酵母菌株在浓度稀释104倍后其长势明显弱于对照；同时，随着Ura 固体培养基上盐浓度的增加，酵母菌株的长势呈逐渐减弱的趋势。

2.2 转基因植株的获取

喷施草铵膦后，大部分T1代植株幼苗枯萎死亡，只有少部分幼苗存活下来(图3)。对存活的植株提取DNA，通过PCR 检测进一步筛选抗性植株，将含有目的基因条带的拟南芥株系继续筛选培养，获得稳定遗传的T3代植株(图4)。

图3 草铵膦筛选后的抗性植株Figure 3 Screening of transgenic plants using glufosinate

图4 转基因拟南芥T3 代植株Figure 4 Transgenic Arabidopsis thaliana (T3 generation)

2.3 盐胁迫下过表达ZjNAC3 基因拟南芥的形态变化

对过表达ZjNAC3基因的拟南芥株系中的ZjNAC3基因进行表达分析，发现在这些转基因株系中均有ZjNAC3基因的表达，且表达水平不一致，本研究中选用了基因表达量相对较高的40#和57#两个株系进行盐胁迫处理(图5)。

图5 转基因株系T3 代中ZjNAC3 基因的表达水平Figure 5 Expression levels of the ZjNAC3 gene in the transgenic T3 Arabidopsis lines

为了进一步探究ZjNAC3基因是否参与盐胁迫响应，对过表达拟南芥进行盐敏感性测定(图6)，可以看出，盐处理第7 天对照处理中WT 与转基因株系的生长状态基本一致，处理组中WT 的生长状态明显好于转基因株系，这体现在WT 叶片颜色更深，覆盖度更高。相比之下，转基因株系中叶片明显黄化，尤其是40#株系。

图6 150 mmol·L−1 NaCl 处理后转基因拟南芥株系的表型Figure 6 Phenotype of transgenic Arabidopsis thaliana lines grown in the presence of 150 mmol·L−1 NaCl

2.4 盐胁迫下过表达ZjNAC3 基因拟南芥的生理响应

盐胁迫处理后转基因拟南芥与对照相比，生理指标发生了明显变化(图7)。在盐处理7 d 后，两个转基因株系中的脯氨酸含量、丙二醛含量、电解质渗透率显著高于WT (P< 0.05)，表明在盐胁迫下转基因株系受到的伤害程度更高；而可溶性糖含量、叶绿素含量显著低于WT (P< 0.05)，说明转基因株系在盐胁迫下的叶绿素积累和渗透调节的能力受到了明显抑制。

图7 150 mmol·L−1 NaCl 处理7 d 后转基因拟南芥叶片的生理变化Figure 7 Changes in the physiological indexes of transgenic Arabidopsis thaliana treated with 150 mmol·L−1 NaCl over a 7-day period

2.5 抗性基因的表达分析

盐胁迫处理后，WT 中AtAPX1、AtPOD基因的表达水平无显著变化，而AtNHX1基因的表达水平显著高于对照(P< 0.05)，约为对照的1.5 倍；转基因植株中AtNHX1、AtAPX1基因的表达水平在盐处理后分别低于对照1.5 倍和2 倍，AtPOD基因的表达水平显著高于对照4 倍(P< 0.05) (图8)。

图8 150 mmol·L−1 NaCl 处理后抗性基因的表达分析情况Figure 8 Expression of other salt resistance genes following treatment with 150 mmol·L−1 NaCl

3 讨论

NAC 转录因子在调控植物盐胁迫响应方面已有广泛研究，其在盐胁迫调控过程中发挥着重要作用。本研究探究了ZjNAC3对酵母YPH500 菌株的盐敏感性，结果显示，转ZjNAC3的酵母细胞在盐胁迫下长势弱于对照，表明在盐胁迫下ZjNAC3对酵母细胞的生长起负调控作用。

为进一步探究ZjNAC3基因对拟南芥植株耐盐性的影响，本研究通过农杆菌侵染拟南芥的方法获得了转ZjNAC3基因拟南芥植株，并进行盐胁迫处理。结果发现，盐处理后转基因植株中的叶绿素含量均显著低于WT。叶绿素是植物光合作用所必需的色素，其含量降低影响植物的光合效率[20-21]，推测转ZjNAC3基因植株的光合作用受到盐胁迫的明显抑制。可溶性糖既是植物光合作用的产物[22]，也常被作为渗透调节物质[23]。本研究中，盐处理后，对照的可溶性糖含量显著高于过表达株系，说明对照的渗透调节能力强于过表达株系。因此，渗透调节方面反映出过表达ZjNAC3基因植株的耐盐性比WT 弱。

脯氨酸常被视为渗透调节物质，是判断抗逆性的一种指标[24]。而近年来脯氨酸在植物抗逆中的作用存在一定争议，如Yuan 等[25]研究发现，过表达Osa-miR396c的匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)的耐盐性显著提高，然而测定结果发现，转基因株系中的脯氨酸含量显著低于WT，这可能是脯氨酸的稳态比脯氨酸的积累对胁迫下植物的生长发育更重要。也有研究认为脯氨酸的含量是植物在胁迫条件下受损程度的一种指标，例如盐敏感品种的水稻(Oryza sativa)在盐胁迫下脯氨酸含量高于耐盐品种，但其渗透调节能力较低[26]。本研究认为，脯氨酸是衡量胁迫受损的指标之一。盐处理后转基因植株中脯氨酸含量显著高于WT，转基因植株的受损程度高于WT。丙二醛含量和细胞膜透性也是衡量植

株受损程度的指标，盐胁迫条件下植物内产生大量的活性氧自由基，细胞膜膜脂被氧化产生大量丙二醛；细胞膜结构被破坏，细胞膜透性增大，细胞内的电解质、有机物等外泄[27-30]。本研究发现在盐处理后，过细胞膜透性和丙二醛的含量在过表达株系中明显比WT 高，说明过表达株系的损伤更强。anac092-1突变体耐盐性的研究结果与本研究的结果一致：盐胁迫既增强了突变体种子的发芽能力，同时又抑制了叶片衰老；而对于过表达株系中，盐胁迫对植物的生长发育产生了阻碍[8]。

过表达柳枝稷(Panicum virgatum)PvNAC1增强了芽和根中K+的积累，而抑制了Na+的积累，并诱导相关离子转运蛋白基因的表达[9]。AtNHX1基因编码液泡逆向转运蛋白，可以将细胞液中的Na+隔离到液泡中，与植物抗性密切相关[31]。本研究中，在盐胁迫处理后，AtNHX1基因的表达水平在转基因植株中显著低于WT，说明转基因植株将Na+隔离到液泡中的能力弱于WT，这与Apse 等[31]和Zhang 等[32]的研究结果一致。AtAPX1和AtPOD基因分别编码抗坏血栓过氧化物酶(APX)、过氧化物酶(POD)，能够减弱过量活性氧对细胞造成的损伤[33-34]。本研究中，盐处理后转基因植株中AtAPX1和AtPOD的表达水平，与WT 相比分别显著降低和升高，抗氧化酶基因的表达水平不一致。马长乐等[35]研究发现盐胁迫下盐地碱蓬(Suaeda salsa)中SsAPX的表达量增加；而刘香娥等[36]研究发现盐胁迫下西瓜(Citrullus lanatus) POD 和APX 的合成受阻。本研究中，盐胁迫处理与对照的WT 中AtAPX1和AtPOD基因表达水平未显著性变化，表明WT 在经历7 d的150 mmol·L−1NaCl 处理后，体内活性氧已到达稳定水平，抗氧化基因的调节不明显。而转基因植株体内活性氧发生明显的改变，需要激活抗氧化酶基因的转录来维持活性氧的平衡，其中的机制需要进一步研究。

4 结论

为研究日本结缕草ZjNAC3在盐胁迫中的功能，首先通过对转ZjNAC3基因酵母菌株的盐敏感测试，发现ZjNAC3基因减弱了酵母菌株的耐盐性。进一步利用转基因拟南芥株系进行了验证，发现过表达ZjNAC3基因能够使拟南芥植株的耐盐性降低。分析发现ZjNAC3基因可通过减弱转基因株系的渗透调节能力、增加细胞受损程度、降低将Na+隔离到液泡的功能等途径参与盐胁迫调控途径。本研究为进一步研究结缕草中NAC 转录因子的调控机理奠定了基础。