马铃薯脱毒组培快繁技术与实践

房玉洁，张福明，李承永，王教义，赵增建

（济南市农业科学研究院，山东 济南 250316）

病毒病是为害马铃薯生长的主要病害之一，病毒的侵染会严重影响马铃薯的生长、发育、产量与品质，应用植物脱毒技术脱除马铃薯植株体内的病毒，可恢复其抗病、抗逆性，提高产量和品质。利用植物组织培养快繁技术可以在短时间内呈几何级数繁育大量所需苗木。脱毒组培快繁技术是现代生物技术在农业上应用较早且成熟的技术，近20年来脱毒种苗的繁育和推广应用快速发展，在植物品种改良上被应用得越来越广泛。但优质脱毒种苗普及率仍较低，如作为粮菜兼用的我国第四大作物马铃薯是脱毒种苗推广应用较广泛、增产效果较好的，脱毒后，马铃薯种性得到恢复，长势强，抗病、抗逆性增强，种苗纯度高、整齐度好，一般产量提高30%以上，商品性好，节肥、省药且环保；而其脱毒优质种苗在全国应用只有50%～60%；因此，还需大力加强脱毒优良种苗的推广应用。

1 马铃薯病毒病及其危害

1.1 马铃薯病毒病

马铃薯病毒是具有侵染性的微小生物类群，它主要由RNA、DNA与蛋白质外壳构成，通过侵染植株体改变细胞的代谢途径，使细胞的正常生理机能遭到干扰和破坏，影响生长发育，致使叶片褪绿、黄化、花叶、皱缩、变小，株型矮小，果实畸形，产量降低甚至绝产，品质变劣，商品性变差甚至失去商品价值，危害极大。因为目前还没有药剂能将植物体内病毒杀死，所以病毒一旦侵入植物体内很难根除，而马铃薯经长期无性繁殖，病毒长期积累，可能世代都要带毒繁育，严重影响了马铃薯品种的特性，给农业生产造成巨大损失。

据报道，目前全世界已知的植物病毒种类有700多种，中国统计有100多种。几乎所有植物种类都有病毒危害，是仅次于真菌病害的主要植物病害。

1.2 马铃薯病毒病的危害症状

1.2.1 变色

由于营养物质被病毒利用，或病毒造成维管束坏死，阻碍了营养物质的运输，叶片的叶绿素形成受阻或积聚，从而产生花叶、斑点、环斑、脉带和黄化等；花朵的花青素也可因此改变，使花色变成绿色或杂色等，常见的症状为深绿与浅绿相间的花叶症，如烟草花叶病毒病、马铃薯花叶病毒病等。

1.2.2 坏死

植株对病毒的过敏性反应等导致细胞或组织死亡，变成枯黄至褐色，有时出现凹陷。在叶片上常呈现坏死斑、坏死环和脉坏死，在茎、果实和根的表面常出现坏死条等。

1.2.3 畸形

由于正常的新陈代谢受到干扰，体内生长素和其他激素的生成及植株正常的生长发育发生变化，导致器官变形，如茎间缩短，植株矮化，生长点异常分化形成丛枝或丛簇，叶片的局部细胞变形而出现疱斑、卷曲、蕨叶及黄化现象。

1.3 马铃薯病毒病的传播方式和途径

马铃薯等无性繁殖作物经长期的无性繁殖，病毒在植株体内积累。但近些年的研究证明，花粉与种子可传播瓜类及豆类植物的病毒，植物病毒除借带毒的繁殖材料如接穗、鳞茎、块根、块茎等传播外，主要是通过昆虫、螨类及土壤中的真菌、线虫等媒介传播，称介体传播。传毒昆虫以具刺吸式口器者为主，如蚜虫、叶蝉、飞虱、蓟马等，仅少数具咀嚼式口器。它们在为害植物的同时将病毒从病株传到健株上。

2 马铃薯脱毒技术

2.1 脱毒原理

植物体内病毒主要通过维管束流动，因此未形成维管束的茎尖、根尖生长点病毒无法达到，切除植物的生长点，离体培养成植株，可获得脱毒苗，从而获得脱毒种苗。

2.2 脱毒方法

2.2.1 茎尖剥离脱毒法

茎尖剥离脱毒是根据茎尖生长点还没有形成维管束，不含病毒，在高倍解剖镜下，将茎尖剥离到叶原基，切取0.1～0.3 mm的茎尖，接种到培养基上，培养成脱毒试管苗，再进而培育获得脱毒种苗的过程（图1）。

图1 脱毒苗培育流程

2.2.2 热处理脱毒法

将植物种植在花盆中，放在35～45 ℃温度下的光照培养箱内处理2～8周，再切取植物茎段作接穗，从而达到脱毒的目的。

2.2.3 其他脱毒方法

化学处理脱毒：将带毒外植体接种在含有抑制病毒复制的培养基上，经长期培养脱除病毒；愈伤组织培养脱毒：通过器官和组织的培养，分化诱导产生愈伤组织，愈伤组织再分化产生芽，再长成小植株，可以得到无病毒苗。

2.3 脱毒苗检测

经过脱毒处理以后，病毒脱除与否，还要对经脱毒苗处理获得的试管苗进行检测方能确定，不经检测无法确定是否脱毒，脱去什么病毒，也就无法进行应用。

脱毒苗的检测方法有以下几种：指示植物法、 酶联免疫法（ELISA）、PCR扩增与酶联免疫相结合。目前常用的是酶联免疫法，快速且成本低，但准确度较PCR扩增法差，当植株体内病毒含量低到一定程度时，则检测不到病毒的存在。在田间取样较多且要求不太高，进行定性了解时常采用酶联免疫法。相对准确的检测方法首推PCR扩增检测法，在病毒含量极低的情况下就能检测到病毒；因此，试管苗的检测应用这种方法较可靠，但成本高，在样品数量多时，可采用此法。

2.4 对脱毒种苗的认识误区

2.4.1 脱毒种苗不发生病害

有人对脱毒不了解，以为脱毒后的种苗种在地里不发生病害，这种认识是片面的，把病毒病和真菌、细菌性病害混为一体。脱毒只是把种苗体内病毒脱除，土壤、环境中有真菌、细菌，作物仍可能染病，也可重新感染病毒，再次退化。

2.4.2 脱毒种苗可以长期应用

有些脱毒种苗只能用1年，如玉米等杂交种；有些需要年年换种苗，如脱毒马铃薯、草莓；有些作物抗性强，退化慢，可连续应用3～5年，如脱毒甘薯、姜等，但产量会逐年下降。

3 脱毒苗的组培快繁（工厂化生产）、炼苗、移栽

在生产上，为了提高脱毒率，马铃薯脱毒常用热处理加茎尖剥离脱毒的方式进行脱毒。步骤：第一步，高温处理钝化病毒。把选择好的、准备繁育的马铃薯放在35～40 ℃条件下，经30 d左右，可降低花叶病毒的浓度，提高脱毒成功率，同时也进行了催芽。第二步，进行茎尖组织剥离和接种。在经过高温处理和催芽的块茎上取3～4 cm长的幼芽若干个，在无菌室的超净工作台上40倍的解剖镜下，切取0.1～0.3 mm茎尖，接种到培养基上，培养成试管苗。

经过病毒检测已经脱除病毒的试管苗称为脱毒苗，以脱毒苗为基础苗进行组培快繁。基础苗达到3个茎节以上可进行扩繁，将每株苗切为单个带茎节的节段，转到扩繁培养基上进行扩繁，组培快繁速度呈几何倍数增长。1株马铃薯试管苗20 d后可分为3株，40 d后为9株，60 d后为27株，以此类推，只要有足够的人力和空间，1株苗1年后理论上可繁育3.8亿多株。实际生产上，可根据生产需要进行脱毒苗繁育。脱毒种苗工厂化生产流程：培养基配制→培养基高压灭菌→扩繁→培养室培养→炼苗→移栽。

进入生产环节前，还需进行试管苗的炼苗、移栽。马铃薯试管苗室内培养的温湿度相对稳定、光照弱（3 000～5 000 lx），与自然环境差异大，试管苗直接移栽到自然环境条件下，成活率低，需要逐步适应外界的温度、光照、湿度，这一过程称为炼苗。不同品种适应性差异不大。炼苗期间需要保温、保湿和遮阴，温度控制在10～30 ℃，湿度保持在90%以上，遮阴用遮光率为50%～70%的遮阳网覆盖，光照强度在3万～5万lx。

炼苗过程首先进行室外瓶内炼苗7～10 d，然后可移栽到保湿、保温较好的温室、网室，移栽后10～15 d可以逐步去掉遮阳网并通风，适应外界环境，最终达到与外界环境条件一致。

4 脱毒良种体系的建立及推广应用

获得脱毒苗只是第一步，脱毒种苗进入应用必须建立完善的脱毒良种繁育体系，即需要建立接种、培养基配制、灭菌、病毒检测等系列实验室，生产车间等脱毒、组培快繁设施、设备，隔离条件良好的温室、网室组成的原原种（苗）繁育基地，隔离条件良好的原种繁育基地，生产种繁育基地及优良的种苗质量管控体系、储存设施等。诸多环节构成了脱毒种苗良繁体系，缺一不可，否则产品质量得不到有效保证。