基于叶片解剖结构的12个杨树无性系抗旱性分析

王烟霞，樊军锋，程玮哲，高建社，周永学

(西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100)

杨树(Populusspp.)是杨柳科(Salicaceae)杨属(PopulusL.)树种的统称，有100多个种,分布在世界各地，我国分布有53个种，其中35个为特有种。杨树因具有生长快、适应性广、抗逆性强等优良特性，成为西北地区“三北”防护林体系的主栽树种，在缓解木材短缺和治理生态环境方面均占有重要地位[1]。在我国，杨树的地理分布范围在25°～53° N和80°～134° E，主要集中于西北、华北、东北及西南等干旱、半干旱地区[2]。由于在干旱、半干旱地区缺少灌溉条件，杨树的生长受到严重抑制，从而限制了其经济和生态效益的充分发挥，因此选育出抗旱性强的杨树品种具有重要意义[3]。

长期在干旱环境中生长的植物，会不断形成多种抗旱、耐旱的形态和叶片结构特征，其中叶片结构特征最能反映植物适应干旱环境的能力[4-5]，而在抗旱性评价中，叶片的解剖结构指标最能反映植物的抗旱能力[6]。王怡[7]选取角质层厚度、栅栏组织厚度/叶肉组织厚度、第一层栅栏组织细胞密集度等指标，对沙棘、文冠果、虎榛子的抗旱能力进行了鉴定。刘红茹等[8]以5种木犀科植物为研究材料，指出主脉厚度、栅栏组织厚度等可以反映植物抗旱能力，是叶片解剖结构的重要指标。邱兴等[9]筛选出叶片厚度、主脉厚度、栅栏组织与海绵组织厚度之比3项主要指标，并结合模糊数学的隶属函数法综合评价了6个杨树无性系的抗旱性。近年来，评价杨树抗旱性的研究仍主要集中于盆栽控水后生理生化指标的变化方面，而通过定量分析叶片解剖结构指标来评价杨树抗旱性的研究较少[1-5,10-11]。

为了更好地评价各杨树无性系的抗旱能力，本研究选取自意大利引进的欧美杨与银白杨的杂交无性系(La、Pa、Ta、Qg、Ti、A23、A39、A50、A54)及其近缘无性系，依据角质层厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、叶片厚度、主脉厚度、栅栏组织厚度、叶片组织结构紧密度(CTR)等7项指标进行植物抗旱能力评价，以期为进一步选育优良抗旱杨树无性系及其资源利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

12个供试杨树无性系均来源于西北农林科技大学渭河试验站种质资源库[12](表1)。其中欧美杨无性系 La、Pa、Ta、Qg、Ti、107 和银白杨无性系 A23、A39、A50、A54、I-101 均为意大利引进无性系，84K杨由韩国引进。试验材料为 1 年生杨树扦插苗的叶片，统一在2020-09-01采摘于扦插苗株行距为30 cm×40 cm的苗圃。每个无性系选取3株受光均匀的代表性植株，每株选取向阳面树冠中部的功能叶各15片，沿叶片主脉的1/2中心处切取0.5 cm×1 cm的小片，立即投入FAA固定液中固定24 h以上,以确保细胞原生质凝固。

表1 12个杨树无性系及其遗传背景Table 1 12 poplar clones and their genetic background

1.2 方 法

取在FAA固定液中固定24 h以上的供试叶片，采用常规石蜡切片法制作切片，经体积分数70%，80%和95%的酒精梯度脱水后，用体积比为1∶1的无水乙醇和二甲苯进行脱蜡，之后用体积分数100%二甲苯再次脱蜡；完成脱蜡后进行浸蜡包埋，使用Lecia半自动切片机切片，厚度为 10～12 μm；切片用二甲苯脱蜡透明、番红-固绿对染和中性树胶封固。制作好的切片于Motic光学显微镜下观察，选择结构清晰完整的石蜡切片用 Motic Image Advanced 3.2测量软件拍照，并测算和记录角质层厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、叶片厚度、主脉厚度、栅栏组织厚度和叶片组织结构紧密度等叶片形态解剖结构指标，每个视野重复30次。其中叶片组织结构紧密度按下式计算：

叶片组织结构紧密度(CTR)=(栅栏组织厚度/叶片厚度)×100%。

1.3 数据处理

采用Excel 2003、SPSS 20.0和Origin 2020软件对数据分别进行单因素方差分析、相关性分析和主成分分析，最后采用隶属函数法对12个杨树无性系的抗旱能力进行综合评价。

1.3.1 单因素方差分析 利用SPSS 20.0软件对12个杨树无性系叶片的解剖结构指标进行单因素方差分析(Duncan’s法)，选取95%显著水平的结果(P=0.05)进行比较。

变异系数(CV)=(标准差/平均值)×100%。

1.3.2 相关性分析 利用Origin 2020软件中的Pearson相关性分析方法，对12个杨树无性系的7个叶片解剖结构指标之间的关系进行相关性分析，以更直观地了解指标间的关联程度。

1.3.3 主成分分析 运用主成分分析法对12个杨树无性系的7个叶片解剖结构指标进行进一步分类和简化，因指标间具有不同程度的相关性，信息存在相互重叠，叶片结构变异过小的指标往往会使分析结果不同，选取变异系数大的指标则分析结果更具意义[13]。因此本研究选取累积贡献率≥85%的指标作为抽取主成分的原则，并结合各主成分的贡献率、各主成分中每个指标的载荷量、变异系数的大小[14-16]进一步分类和简化，筛选出具有代表性的指标，以提高杨树抗旱性评价分析的效率和可靠性。

1.3.4 杨树抗旱性综合评价 采用模糊数学的隶属函数法[17]，对12个杨树无性系的抗旱性进行综合评价。按隶属函数计算标准，求得依据主成分分析法选择的 3 项主要指标的抗旱隶属函数平均值，平均值大小与抗旱性强弱呈正相关，即平均值越大，表明抗旱性就越强[18]。隶属函数值的计算公式如下：

(1)

如果某一指标与抗旱性评价为负相关，可用反隶属函数进行计算，反隶属函数的计算公式如下：

(2)

式中：X(μ)为隶属函数值，Xij为i无性系j指标的测定值，Xj min和Xj max为所有供试无性系中j指标的最小值和最大值。

2 结果与分析

2.1 12个杨树无性系叶片的解剖结构

2.1.1 表皮特征 由表 2 可知，各杨树无性系角质层比较发达，有利于减少水分散失，其厚度为1.94～17.07 μm，其中Pa的厚度最小，A50的厚度最大，变异系数为 40.11%；从角质层厚度来看，A50抗旱性较强。上表皮厚度为5.82～26.23 μm，变异系数为 49.02%；下表皮厚度为3.28～18.96 μm，变异系数为 50.08%。上述 3 项指标在各杨树无性系间存在差异。

图1显示，杨树叶片上表皮和下表皮均由1层细胞组成，细胞排列整齐紧密，呈矩圆形或矩形，表皮由厚角质层覆盖。

1.84K;2.I-101;3.107;4.A23;5.A39;6.A50;7.A54;8.La;9.Pa;10.Qg;11.Ta;12.Ti。图2同1.84K;2.I-101;3.107;4.A23;5.A39;6.A50;7.A54;8.La;9.Pa;10.Qg;11.Ta;12.Ti.Fig.2 is the same图1 12个杨树无性系叶片的显微结构(10×10)Fig.1 Microstructure of leaves of 12 poplar clones(10×10)

2.1.2 中脉特征 由表 2 可以看出，12个杨树无性系的主脉比较发达，厚度在496.99～1 712.35 μm，其中Pa的厚度最小，107的厚度最大，变异系数为 32.04%。由图2可以看出，12个杨树无性系的维管束均为外韧维管束，其中无性系107具有3束维管束，A23、A39、A50、A54、La、Ti和Qg有2束维管束，而84K、I-101、Pa和Ta只有1束维管束。

图2 12个杨树无性系维管束横切面的显微结构(10×40)Fig.2 Microstructure of transverse section of vascular bundle of 12 poplar clones(10×40)

2.1.3 叶肉组织特征 观测结果(图1)表明，供试12个杨树无性系的叶片全为异面叶，其中无性系Ta、La具有双层栅栏组织，其余无性系均只有一层栅栏组织。由表 2 可知，12个杨树无性系叶片厚度为39.62～201.59 μm，其中Qg的厚度最大，Pa的厚度最小，变异系数为 39.13%；栅栏组织由2层长柱形细胞组成，排列紧密(图1)，其中栅栏组织厚度最大的无性系为 107(86.94 μm)，Pa 的厚度最小(25.53 μm)，变异系数为 27.87%；叶片组织结构紧密度(CTR)为27%～66%，其中La的最小(27%)，Pa的最大(66%)，变异系数为 59.09%。

2.2 12个杨树无性系叶片解剖结构指标间的相关性

12个杨树无性系叶片解剖结构指标间的相关性分析结果见表3。

表3 12个杨树无性系叶片解剖结构指标间的相关性分析Table 3 Correlation analysis between anatomical structure indexes of 12 poplar leaves

由表3可知，在12个杨树无性系的7个叶片解剖结构指标中，角质层厚度与叶片厚度、栅栏组织厚度之间呈极显著正相关(P≤0.01)；上表皮厚度与下表皮厚度、叶片厚度、主脉厚度、栅栏组织厚度之间呈极显著正相关(P≤0.01),与CTR之间呈极显著负相关(P≤0.01)；下表皮厚度与叶片厚度、主脉厚度之间呈极显著正相关(P≤0.01)，与CTR之间呈极显著负相关(P≤0.01)；叶片厚度与主脉厚度、栅栏组织厚度之间呈极显著正相关(P≤0.01)，与CTR之间呈极显著负相关(P≤0.01)；主脉厚度与栅栏组织厚度之间呈极显著正相关(P≤0.01)，与CTR之间呈极显著负相关(P≤0.01)；栅栏组织厚度与CTR之间呈极显著正相关(P≤0.01)。

2.3 12个杨树无性系叶片解剖结构指标的主成分分析

从表4可知，在主成分分析中前3个主成分的累积贡献率已经达到85.741%，说明前3个主成分可以较好地体现叶片解剖结构7个指标的大部分信息，因此选取前3个主成分，并计算出相应的载荷矩阵。

表4 12个杨树无性系叶片解剖结构指标的主成分分析Table 4 Principal components analysis of anatomical indexes of 12 poplar leaves

从表5可知，各指标在3个主成分中的载荷值有很大差异，指标的载荷值越大，说明其对主成分的贡献越大，典型性越优。在第1主成分中，CTR和主脉厚度有较高的载荷值，反映了植物在干旱环境下的光合能力和自我保护能力，其中CTR的变异系数最大(59.09%)、载荷值最高(0.918)，因此选择CTR作为第 1 主成分的典型指标；第2主成分中，角质层厚度的载荷值最大(0.796)，远高于其他指标，反映对叶片细胞的保护和机械支撑能力，因此选择角质层厚度作为第 2 主成分的典型指标；第 3 主成分中，叶片厚度的载荷值最高(0.725)，反映了叶片贮水保水的能力，因此选择叶片厚度作为第 3 主成分的典型指标。

表5 12个杨树无性系叶片解剖结构指标的主成分载荷矩阵Table 5 Principal component load matrix among anatomical structure indexes of 12 poplar leaves

2.4 12个杨树无性系抗旱性的综合评价

根据主成分分析结果选择的 3 个最佳指标角质层厚度、叶片厚度、CTR，计算隶属函数平均值，结果如表 6 所示。对12个杨树无性系的隶属函数平均值进行排序，可知其抗旱能力从高到低依次为：A50>Qg>Ti>A23>La>107>Ta>A54>I-101>A39>84K>Pa(表6)。

表6 12个杨树无性系抗旱性的综合评价结果Table 6 Comprehensive evaluation of drought resistance in 12 poplar clones

3 讨论与结论

长期生长在干旱、半干旱地区的植物，其叶片解剖结构会逐渐发生适应性变化。根据本研究结果，12个杨树无性系因长期适应干旱缺水的环境，具有共同的旱生结构特征，但不同无性系的叶片解剖结构特征存在不同程度的差异，主要表现为以下几点：

(1)叶片表皮外壁有发达的角质层。角质层是不透水的脂肪性物质，可以减少叶片水分蒸发；另外，发达的角质层具有一定的机械支撑能力[19]，植物缺水时叶片不至于立即萎蔫。非耐旱性植物的角质层厚度一般在0.03～3 μm[20]，本研究中供试杨树无性系角质层厚度为1.94～17.07 μm，厚度高于非耐旱性植物，说明其耐旱性较强。角质层厚度排序为A50>A23>Qg>A54>I-101>Ta>La>Ti>107>A39>84K>Pa，这是A50、Qg、A23综合抗旱能力较强，A39、84K、Pa综合抗旱能力较弱的原因之一。

(2)叶片较厚。叶片越厚，表明其贮藏水分的能力越强[21]，越有利于植物在干旱环境下适应生存。非耐旱性植物的叶片厚度一般小于90 μm[22]，本研究中12个杨树无性系叶片厚度为39.62～201.59 μm，除Ta和Pa外，其他无性系叶片厚度均大于非耐旱性植物。叶片厚度排序为Qg>La>Ti>107>A50>A54>A23>A39>84K>I-101>Ta>Pa，由此可知Ti、107角质层虽薄，但其叶片较厚，因此二者抗旱能力也较强。

(3)有多束维管束。叶片是植物的主要光合部位，维管束在叶片和叶鞘中担任着运输养分和水分的功能，负责将光合作用的产物运输到植株各部位，以供给自身的正常生命活动[23]。本研究中，无性系107具有3束维管束，这也是其角质层厚度不大但抗旱性较强的另一个原因。无性系A23、A39、A50、A54、La、Ti和Qg具有2束维管束，无性系84K、I-101、Ta、Pa只有1束维管束。

(4)拥有发达的栅栏组织。干旱地区光照强烈，高度发达的栅栏组织可以保护叶肉细胞免受灼伤[24]，其中栅栏组织分布于叶的背腹两面，可使干旱缺水植物萎蔫时减少机械损伤[25]。本研究中，只有无性系Ta、La具有双层栅栏组织，这也是Ta虽只有1束维管束但抗旱性却高于部分有2束维管束无性系的原因。

本研究通过主成分分析筛选出角质层厚度、叶片厚度和叶片组织结构紧密度(CTR)3个指标为抗旱性评价的主要指标，运用隶属函数法得到12个杨树无性系抗旱性大小排序为A50>Qg>Ti>A23> La>107>Ta>A54>I-101>A39>84K>Pa。其中 A50 因其角质层和叶片较厚、拥有2束维管束及发达的栅栏组织结构，因此抗旱性优于其他无性系；无性系84K、I-101、Pa只有1束维管束，且角质层和叶片较薄，因此其抗旱性相对较弱。可见叶片解剖结构指标能够较好地反映杨树的抗旱特性，所得结果比较可靠，可以作为评价12个杨树无性系抗旱能力的指标。12个杨树无性系中，A50、Qg、Ti、A23和La抗旱性较强，可作为优良杨树无性系进行推广。