不同授粉方式下玉米籽粒品质性状的QTL定位

李冉冉，张秀英，李 婷，杨炳鹏，于芮苏，李冬梅，李 勤，徐淑兔

(西北农林科技大学 农学院，西北旱区玉米生物学与遗传育种重点实验室，陕西 杨凌 712100)

玉米(Zeamays)是全球也是中国第一大作物，在保障国家粮食安全中占有重要地位[1]。近年来，由于农业生产的发展，玉米产量显著提高，但却伴随着玉米品质的下降，这对当前玉米市场及今后玉米产业的发展带来一定影响[2]。改善玉米品质的重要途径是选育优质玉米品种[3]。玉米籽粒品质性状表现出数量遗传的特点，即受许多数量基因位点和环境因子的共同作用[4]。因此开展玉米籽粒品质性状的遗传分析，揭示品质相关性状的遗传机制，可以为优良特用玉米新品种的选育提供理论依据。

目前，国内外关于玉米籽粒营养品质及相关性状QTL定位的研究较多。李学慧等[5]利用高油玉米自交系GY220与普通玉米自交系8984为亲本,构建了284个F2∶3家系群体及含有185个SSR标记的玉米遗传连锁图谱，对自交授粉的玉米籽粒蛋白质含量进行定位，共检测到4个QTL，单个QTL贡献率为3.86%～5.17%，所有QTL的增效基因均来自高油亲本GY220。Li等[6]利用368份玉米自交系开展自交籽粒油分的全基因组关联分析，鉴定到74个关联位点，结合代谢通路及功能注释锚定到26个油分相关基因。Zhang等[7]用源于178和P53的包含498个家系的RILs群体在自交授粉下的果穗，在6种环境下检测到25个蛋白质QTL、13个淀粉QTL、31个油分QTL和15个赖氨酸含量QTL，其中有5个QTL可解释的表型变异超过10%。Wang等[8]利用3个重组自交系群体在3个环境下玉米籽粒的蛋白质、淀粉、油分等性状，共定位到38个玉米籽粒品质性状QTL位点。赵志鑫等[9]以源自X178和K12的150份玉米重组自交系为材料，对历时3年7个环境下开放授粉的玉米籽粒蛋白质、淀粉、油分等性状进行QTL定位分析，共挖掘到20个相关QTL位点。李雪莹等[10]以5M017、5D07为亲本杂交组配的110株F2代分离群体为材料，共检测到17个与玉米淀粉含量有关的QTL。上述有关玉米品质性状的研究所用材料基本为单一群体自交授粉或者开放授粉收获的籽粒，而对同一群体不同授粉方式下玉米籽粒品质性状的QTL定位研究尚未见报道。而表型变异是由遗传背景和环境共同调控的，因此开放授粉与自交授粉玉米籽粒的品质表型表现应该存在差异。本研究以陕A群选育的自交系KA105和陕B群选育的自交系KB020为亲本，构建包含201个F5∶6家系的重组自交系群体作为试验材料，对1年3点环境下开放授粉和自交授粉玉米籽粒的蛋白质、淀粉、油分和纤维进行表型鉴定，同时利用靶向测序获得的SNP位点构建遗传连锁图谱，挖掘不同授粉方式下定位到的QTL以及在开放和自交授粉方式下特异表达的QTL，以期揭示这两种授粉方式对玉米籽粒品质性状的影响，并为玉米籽粒品质遗传改良和分子育种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以2个优良玉米自交系KA105和KB020杂交，经过连续多代自交获得包含201个家系的F5∶6代重组自交系(RILs)群体，以其作为试验材料。

1.2 田间试验设计

田间试验于2019年在陕西的榆林(YuL)、汉中(HZ)和杨凌(YaL)3地进行。201个重组自交系和两个亲本均采用完全随机区组设计，单行区2重复，行长5 m，行距0.6 m，株距22.2 cm。榆林点仅收获开放授粉果穗，汉中点收获开放授粉果穗和自交授粉果穗，杨凌点仅收获自交授粉果穗。水肥等其余田间管理措施同当地生产管理。

1.3 品质性状的测定及分析

田间收获的果穗自然风干脱粒，每个家系选取300粒均匀一致、无病害的籽粒，采用Perten公司(瑞典)生产的DA7200型近红外谷物分析仪，测定F5∶6代群体及亲本KA105和KB020籽粒的蛋白质、油分、淀粉和纤维含量，每个样品重复测定3次，取其平均值作为该家系的表型值。其中，榆林点和汉中点每个处理群体2个重复的表型平均值代表该年份的表型值，杨凌点单个重复的表型值代表该年份的表型值。采用最佳线性无偏预测法(best linear unbiased prediction，BLUP)并结合汉中点开放授粉和榆林点开放授粉条件下的表型值，估计开放授粉条件下每个家系各性状的BLUP值；结合汉中点自交授粉和杨凌点自交授粉条件下的表型值，估计自交授粉条件下每个家系各性状的BLUP值。

利用统计软件SPSS 22.0，对F5∶6代 RILs 群体以及亲本的蛋白质、油分、淀粉、纤维4个籽粒品质性状进行基本统计描述分析，计算亲本和自交系群体的最大值、最小值、峰度值、偏度值等。用每个地点2个重复的品质性状平均值以及各性状分别在两种授粉方式下2个地点的BLUP值，绘制每个品质性状含量值的箱线图，并对两种授粉方式下各性状在同一环境(汉中)中的2个重复值以及每个性状在两种授粉方式下2个地点的BLUP值分别进行相关性分析，用每个性状在该年份的表型值进行方差分析，计算每个性状在开放授粉和自交授粉下的广义遗传力。广义遗传力(H2)的计算公式如下：

1.4 基因型检测与QTL定位

在5叶期，田间采集KA105、KB020及其F5∶6代群体叶片，采用改良的CTAB法提取基因组DNA[11]，经检测合格后送至石家庄博瑞迪生物技术有限公司进行基因型检测。采用靶向测序基因型分型(genotyping by target sequencing, GBTS)技术[12]对所有样品进行基因分型，将获得的序列与参考基因组B73比对，从而获得高质量SNP位点。剔除在两个亲本之间无多态性、缺失率≥10%、杂合度≥20%且次要等位基因频率≤0.05的SNP位点，筛选获得的标记后，利用QTL ICIMapping V4.2软件构建连锁图，通过分组、排序、修正等步骤，使用Kosambi函数[13]将重组频率转换为Centimorgan(cM)，采用QTL ICIMapping V4.2软件的完备区间作图法(ICIM)，对4个玉米籽粒品质性状在开放授粉和自交授粉条件下2个地点的BLUP值分别进行QTL分析[14]。逐步回归标记进入的概率(probability in stepwise regression,PIN)设为0.001，步长(walking speed)为1 cM，采用模拟运算(permutation)1 000次的方法确定似然函数比值对数值(logarithm viscosity odds,LOD)，当某个位置检测到的LOD值大于LOD阈值时，视为该位置存在1个QTL。本研究中QTL命名以授粉方式、性状及其所在染色体编号和顺序依次命名，如10号染色体上检测到2个开放授粉条件下蛋白质含量的QTL，则按照其在染色体上的物理位置分别命名为qOPro10-1和qOPro10-2，其余以此类推。

2 结果与分析

2.1 玉米亲本和RILs群体籽粒品质性状表型分析

由表1可以看出，各环境下不同授粉方式玉米亲本及RILs群体的蛋白质、油分、淀粉和纤维含量存在差异。两种授粉方式下母本KA105的蛋白质、淀粉和纤维含量较父本KB020高；两种授粉方式下亲本的油分含量存在环境差异，去除环境影响后由BLUP值可知，自交授粉时母本KA105的油分含量高于父本KB020，开放授粉时略低于父本KB020。RILs群体中4个籽粒品质性状均表现出双向超亲分离，不同环境下RILs群体的蛋白质、油分、淀粉和纤维含量的峰度及偏度的绝对值均小于1，符合正态分布。由两种授粉方式下2个地点的BLUP值以及两种授粉方式下每个品质性状含量的统计分析可知，开放授粉下的蛋白质和纤维含量极显著低于自交授粉(图1)；开放授粉下的油分和淀粉含量极显著高于自交授粉(图1)。就汉中单个点而言，油分含量在开放授粉和自交授粉条件下的品质性状不存在显著差异，自交授粉下的纤维含量显著高于开放授粉，自交授粉下的蛋白质含量极显著高于开放授粉，淀粉含量表现相反(图1)。

表1 玉米RILs群体及其亲本的籽粒品质性状分析Table 1 Analysis of kernel quality traits of maize RILs population and their parents

HZ-O、HZ-S、BLUP-O、BLUP-S依次表示汉中开放授粉、汉中自交授粉、开放授粉下的BLUP、自交授粉下的BLUP；*表示在P<0.05水平上差异显著，**表示在P<0.01水平上差异显著；圆点表示异常值HZ-O,HZ-S,BLUP-O and BLUP-S indicate open pollination in Hanzhong,self-pollination in Hanzhong,BLUP under open pollination and BLUP under self-pollination,respectively;*,** indicates significant difference at P<0.05,P<0.01 level,respetively;Dots indicate outliers图1 不同授粉方式下玉米籽粒品质性状含量的箱线图Fig.1 Boxplot of kernel quality traits in maize under different pollination methods

通过遗传力分析发现，开放授粉条件下4个玉米籽粒品质性状的广义遗传力均高于自交授粉。开放授粉下，蛋白质、油分、淀粉和纤维含量的广义遗传力分别为90.32%，83.25%，86.73%和87.27%；自交授粉下，蛋白质、油分、淀粉和纤维含量的广义遗传力分别为81.37%，81.31%，78.60%和80.68%(表1)。

由表2可以看出，通过对不同环境、不同授粉方式下玉米籽粒品质性状的方差分析可知，开放授粉下，蛋白质、油分和淀粉含量在不同家系及环境间均表现出极显著差异，纤维含量在两个环境间差异不显著；自交授粉下，蛋白质、淀粉和纤维含量在不同家系及环境间均表现出极显著差异，油分含量在环境间差异不显著，所以本研究采用BLUP进行定位分析以校正环境的影响。

表2 不同授粉方式下玉米籽粒品质性状的方差分析(F值)Table 2 Variance analysis of kernel quality trait under different pollination models in maize(F value)

由图2可以看出，开放授粉下玉米RILs群体籽粒品质性状含量与其对应的自交授粉下籽粒品质性状含量表现出极显著正相关，说明不同授粉方式下玉米籽粒品质性状含量的积累具有高度的协调一致性；此外，不管采用开放授粉还是自交授粉，蛋白质含量与淀粉含量均呈极显著负相关，与纤维含量均呈极显著正相关(P<0.001)。而同一环境(汉中)下的开放授粉和自交授粉RILs群体籽粒品质相关分析结果显示，玉米籽粒蛋白质、油分、淀粉和纤维含量在不同处理群体2个重复间呈极显著正相关，说明生物学重复效果较好，可作进一步研究。

a.BLUP值；b.汉中点2个重复a.BLUP value;b.Two repeats data in HanzhongOPro、OOil、OSta、OFib和SPro、SOil、SSta、SFib含义与表1同；HZ表示汉中点，1、2分别表示重复1、重复2。*、**、***分别表示在P<0.05、P<0.01和P<0.001水平上差异显著OPro，OOil，OSta，OFib and SPro，SOil，SSta and SFib have same meaning as Table 1;HZ means Hanzhong point,while 1 and 2 represent repeat 1 and repeat 2,respectively.*,**,*** indicates significant difference at P<0.05,P<0.01 and P<0.001 level,respectively图2 不同授粉方式下玉米籽粒品质性状的相关性Fig.2 Correlation of kernel quality traits in maize under different pollination methods

2.2 玉米籽粒品质性状遗传连锁图谱的构建

将通过靶向测序获得的序列与参考基因组B73比对，获得13 929个高质量SNP位点，经筛选，最终获得2 248个标记用于构建遗传连锁图。利用QTL ICIMapping V4.2软件构建连锁图，通过分组、排序、修正等步骤，使用Kosambi函数将重组频率转换为cM，结果见图3。图3共包括2 248个SNP标记，图谱全长2 722.8 cM，平均图距1.21 cM。

图3 基于SNP的高密度玉米籽粒品质性状遗传图谱Fig.3 High-density SNP-based genetic map of kernel quality traits in maize

2.3 玉米籽粒品质性状的QTL定位

利用玉米籽粒每个品质性状在2个环境、两种授粉方式下的BLUP值进行QTL定位，经过1 000次的置换检测后，LOD 阈值定义为3.41，结果定位到16个QTL，其中开放授粉条件下检测到6个，自交授粉条件下检测到10个，分布于1、5、6、8、9、10号染色体上(表3,图4)。检测到的QTL位于10号染色体上的最多，有5个；其次，8号染色体有4个；9号和5号染色体上分别检测到3个和2个；在1、6号染色体上各检测到1个QTL。单个QTL解释的表型变异介于5.69%～14.70%，其中有5个QTL表型解释率大于10%(表3,图4)。

表3 RILs群体玉米籽粒品质性状的QTL定位Table 3 Analysis of QTLs for kernel quality traits in RILs population in maize

从外到内的圆圈依次显示：每条染色体的长度，OPro、SPro、OOil、SOil、OSta、SSta、OFib、SFib的QTL映射；紫色阴影显示检测到的QTLs的物理区间；灰色实线代表阈值线，LOD阈值为3.41The circles from outside to inside sequentially show length of all chromosomes,QTL mapping for OPro，SPro，OOil，SOil，OSta，SSta、OFib and SFib.Purple shade shows physical range of detected QTLs.Gray solid line represents the threshold line,and LOD threshold value is 3.41图4 玉米籽粒蛋白质、油分、淀粉和纤维含量QTLs在染色体上的分布Fig.4 Distribution of QTLs controlling kernel protein,oil,starch and fiber contents on chromosomes in maize

2.3.1 蛋白质QTL定位 两种授粉方式下共检测到7个与蛋白质含量相关的QTL，分布在1、8、9、10号染色体上，表型解释率介于5.84%～14.56%。其中开放授粉条件下2个QTL，自交授粉条件下5个QTL。在两种授粉条件下同一区段检测到的QTL有qOPro9-1/qSPro9-1(简称qPro9-1)和qOPro10/qSPro10(简称qPro10)。qPro9-1在开放授粉和自交授粉条件下分别解释5.84%和5.69%的表型变异，有利等位基因来源于母本KA105；而qPro10在开放授粉和自交授粉条件下分别解释14.56%和8.34%的表型变异，有利等位基因均来源于父本KB020。在自交授粉条件下检测到3个与蛋白质含量相关的特异QTL，分别为qSPro1、qSPro8、qSpro9-2(表3，图4)。

2.3.2 油分QTL定位 根据两种授粉方式下油分含量BLUP值数据共检测到5个QTL，其中开放授粉条件下2个，自交授粉条件下3个，分布于第5、6、8、10号染色体上，单个QTL解释的表型变异介于6.29%～12.02%，qOOil5-1和qSOil6可解释的表型变异均大于10%，为主效QTL。其中qOOil5-1有利等位基因来源于父本KB020，qSOil6有利等位基因来源于母本KA105(表3，图4)。

2.3.3 淀粉QTL定位 两种授粉方式下共检测到2个与淀粉含量相关的QTL，开放授粉和自交授粉条件下各1个，均分布于10号染色体上，qOSta10-1和qSSta10-2分别解释表型变异为9.32%和8.81%，2个QTL有利等位基因均来源于母本KA105(表3，图4)。

2.3.4 纤维QTL定位 两种授粉方式下共检测到2个与纤维含量相关的QTL，开放授粉和自交授粉条件下各1个，均分布于8号染色体上。开放授粉条件下检测到qOFib8-1，贡献率为12.59%；自交授粉条件下检测到qSFib8-2，贡献率为14.70%。2个QTL有利等位基因来源于母本KA105(表3，图4)。

2.4 汉中点不同授粉条件下QTL定位分析

因汉中点同时进行了自交授粉和开放授粉试验，故本研究以汉中点为例开展了同一环境下不同授粉方式的QTL定位分析，结果见表4。由表4可知，汉中点共定位到18个QTL位点，其中开放授粉下8个，自交授粉下10个，单个QTL解释的表型变异为3.09%～16.23%。汉中点开放授粉与自交授粉下分别检测到的蛋白质含量相关QTL(qhzOPro10-1和qhzSPro10-2)几乎被定位在同一区段，且该区段在本研究基于BLUP值的QTL定位中两种授粉方式下均检测到，具有较高的遗传稳定性，结合表3结果可知，qhzOPro10-1、qhzSPro10-2、qOPro10、qSPro10的贡献率分别为14.81%，16.23%，14.56%和8.34%，说明qPro10为玉米籽粒蛋白质含量的主效QTL，可作为玉米品质分子辅助育种的候选位点。同样，在汉中点开放授粉与自交授粉下检测到的淀粉含量相关QTL(qhzOSta10-1和qhzSSta10-2)以及本研究中检测到的qOSta10-1与qSSta10-2(表3)被定位在邻近的区段。在汉中点开放授粉下检测到的油分含量相关QTL(qhzOOil5-1和qhzOOil5-2)分别与本研究检测到的qOOil5-1和qOOil5-2(表3)被定位在同一区段。检测到的纤维含量相关QTL中，汉中点开放授粉的qhzOFib8-1及自交授粉的qhzSFib8-2分别与本研究检测到的qOFib8-1及qSFib8-2位于同一区段。

表4 汉中点玉米籽粒品质性状的QTL定位Table 4 Analysis of QTLs for kernel quality traits in Hanzhong in maize

3 讨 论

蛋白质、油分和淀粉是普通玉米籽粒的主要营养成分，采用不同作图群体时其QTL定位结果各有异同[15]。本研究利用KA105/KB020构建的F5∶6群体进行玉米籽粒的蛋白质、淀粉、油分和纤维含量定位，与前人研究结果比较发现，存在较多共同QTL：(1)在两种授粉方式下均检测到的蛋白质含量相关的qPro9-1(qOPro9-1/qSPro9-1)与Zhang等[7]定位到的q2Bp9-1位于相同的bin区间；两种授粉方式均检测到的qPro10(qOPro10/qSPro10)与Zhang等[7]定位到的q3Bp10-1、q2Xp10-1、q3Xp10-1以及赵志鑫等[9]定位到的qPro10、Li等[16]定位到的qPRO2-10-1、兰天茹等[17]定位到的qPRO10a、赖国荣等[18]定位到的qpc10_1位于同一bin区域。(2)两种授粉方式共同检测到的淀粉含量相关的qSta10-1(qOSta10-1/qSSta10-2)，与孙海艳等[19]定位到的qstarc10和李学慧等[20]定位到的qSTA10-1位于同一bin。(3)Li等[6]利用368份玉米自交系全基因关联分析检测到的3个油分相关基因GRMZM2G065194、GRMZM2G439195和GRM-ZM2G035779,位于本研究中检测到的qOOil5-2区间，且该区间与Yang等[21]定位到的qEEWR5位于相同bin上；qOOil5-1与Yang等[22]定位到的Oil5、赵志鑫等[9]定位到的qOil5-3位于相同bin区域。综上所述，本研究检测到的QTL中有8个QTL位点在先前的研究中被检测到，分布于5、9、10号染色体上。而分布于1、6、8、9、10号染色体上的另外8个QTL为本研究新检测到的QTL，包括蛋白质含量相关QTL-qSPro1、qSPro8、qSPro9-2，油分含量相关QTL-qSOil6、qSOil8、qSOil10，纤维含量相关QTL-qOFib8-1、qSFib8-2。这些QTL附近是否存在控制玉米籽粒品质性状的基因有待于进一步验证和挖掘。

本研究结果显示，自交授粉下测得的蛋白质含量和纤维素含量极显著高于开放授粉，说明采用自交授粉比开放授粉更有利于玉米籽粒中蛋白质和纤维的积累;开放授粉下的油分含量以及淀粉含量均显著高于自交授粉，说明开放授粉更有利于油分和淀粉的积累。而玉米油分含量是玉米籽粒品质的重要指标，玉米油属于高品质营养健康植物油脂，人们长期食用能够有效地预防冠心病以及老年动脉硬化的发生, 因而在实际应用中具备较高的营养价值与经济价值[23]；淀粉是玉米籽粒的第一大贮藏物质，约占到籽粒干质量的70%[24](本研究为67.21%～75.47%)，玉米籽粒产量很大程度上取决于淀粉含量的有效合成和积累。因此，本研究结果可为特用玉米育种提供基础参考。

4 结 论

本研究利用201份玉米自交系及其亲本在两种授粉方式下3个地点的表型值对玉米籽粒品质性状的BLUP值进行QTL定位，结果共检测到16个品质性状相关QTL，其中开放授粉条件下检测到6个QTL，自交授粉条件下检测到 10个QTL，有5个QTL解释的表型变异大于10%。2个与蛋白质含量相关的QTL(qPro9-1和qPro10)可以同时在两种授粉方式下检测到，受授粉方式的影响较小，自交授粉下检测到3个与蛋白质含量相关的特异QTL；两种授粉方式下在10号染色体的临近位置各检测到1个淀粉含量相关QTL(qOSta10-1和qSSta10-2)；在开放授粉和自交授粉条件下各检测到1个纤维素含量相关QTL，分别检测到2个和3个与油分含量相关的QTL。