猪萨佩罗病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

李倩倩，赵福杰，丁庆文，张云飞，郑兰兰,2

(1 河南农业大学 动物医学院，河南 郑州 450002；2 河南省动物性食品安全重点实验室，河南 郑州 450002)

猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus，PSV)是球形、无囊膜、直径约30 nm的单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科，萨佩罗病毒属[1]。PSV全基因组大小约为7.5 kb，含有一个开放阅读框，编码4个结构蛋白(VP1～VP4)和7个非结构蛋白(2A～2C,3A～3D)[2]。由于PSV最初是从腹泻猪的肠道中分离得到，故曾命名为猪肠道病毒(porcine enterovirus，PEV)8型，属于PEVⅡ群[3]。PSV只有一种血清型，可感染家猪和野猪[4]，引起猪腹泻、肺炎、繁殖障碍、脑脊髓炎等多系统综合征，同时也可表现为无明显症状的亚临床感染[5]，若不加以防控，会给养猪业带来较大的威胁[6]。PSV的发现最早可追溯到20世纪60年代的英国[7]，之后在中国、西班牙、巴西、韩国[5,8-10]等国家被相继报道，在世界范围内分布广泛。Lan等[5]对中国华东地区2009-2010年收集的960份猪粪便样本进行流行病学调查，结果发现，PSV感染的阳性率为17.2%，且10～20周龄的猪感染率最高。Cano-Gómez等[8]对来自西班牙的63份猪腹泻样品进行检测，PSV的阳性率为6.4%，而且发现该病毒与猪捷申病毒等病原存在混合感染现象。Son等[10]对100份猪腹泻病料进行检测，PSV的感染率高达34%，但是单独感染PSV的阳性率仅为5.9%。

目前，针对PSV的检测方法主要有病毒分离与鉴定[5]、RT-PCR[2]和间接免疫荧光[11]方法等，这些方法在临床检测中发挥了重要作用。但这些检测方法相对费时，且敏感性较差，不适宜进行PSV早期感染的诊断，并且这些方法均不能对宿主体内病毒含量进行准确定量，因此建立一种快速、可定量、灵敏的检测方法对PSV的临床诊断是非常必要的。本研究建立了PSVTaqMan 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法，并对该方法的敏感性、特异性、重复性以及临床应用效果进行了验证，以期为PSV的早期诊治提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 毒株和临床检测样品 猪萨佩罗病毒、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，均由河南省动物性食品安全重点实验室鉴定并保存。临床病料83份，为2018-2019年在河南不同地区猪场收集到的样本，其中粪便样品39份(河南省周口市22份，平顶山市7份，许昌市4份，开封市4份，新乡市2份)，肠道样品44份(剖检自腹泻仔猪，南阳市17份，漯河市7份，鹤壁市5份，新乡市4份，开封市4份，周口市4份，平顶山市3份)。

1.1.2 试剂及仪器 核酸纯化柱(RNA专用)，购自索莱宝生物科技有限公司；反转录试剂盒、质粒提取试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；BM 2000+DNA Marker，购自北京博迈德生物技术有限公司；DNA凝胶回收试剂盒，购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司； Premix ExTaqTM、pMD-18T载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞，购自宝生物工程(大连)有限公司；CFX96实时荧光定量PCR仪，购自Bio-Rad公司(美国)。

1.1.3 引物和探针的设计与合成 从GenBank下载PSV的全基因序列，选择其保守的5′UTR设计2对特异引物F1/R1和F2/R2及探针P(表1)，引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，探针P的5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记TAMRA-N荧光淬灭基团。

表1 引物与探针信息Table 1 Information of primers and probe

1.2 核酸提取及反转录

将病毒样品和临床样品经无菌处理后，参照TRIzol总RNA提取说明书提取PSV、TGEV、PDCoV、PEDV和PRRSV等的总RNA，利用Vazyme反转录试剂盒反转录为cDNA，-20 ℃保存。

1.3 阳性质粒标准品的制备

以PSV cDNA为模板进行PCR扩增，并设以ddH2O代替模板的处理作为阴性对照。PCR反应体系为：2×RapidTaqMaster Mix 13 μL，ddH2O 9 μL，F1和R1引物各0.5 μL，模板2 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，使用V-ELUTE Gel Mini Purification Kit 回收目的片段，将目的片段连接到 pMD-18T载体上，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，经氨苄抗性的固体LB平板培养基筛选后挑取疑似单一菌落，扩大培养，送菌液到武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序鉴定。提取阳性重组质粒，测定浓度之后计算拷贝数，用去离子水将重组质粒稀释成(3.88×100)～(3.88×109) 拷贝/μL的溶液，作为模板标准品，用于标准曲线的绘制。

1.4 PSV TaqMan RT-qPCR检测方法的建立

1.4.1 荧光定量PCR反应体系和条件的优化 以3.88×105拷贝/μL的标准质粒为模板，进行TaqMan RT-qPCR反应，反应总体系为25 μL：Premix ExTaqTM12.5 μL,模板cDNA 3 μL，10 μmol/L 引物F2、R2各0.25，0.4，0.5，0.75或1.0 μL，5 μmol/L探针P 0.5，0.8，1.0，1.5或2.0 μL，其余用ddH2O补齐。依据引物和探针的退火温度分别在56，58，60，62 ℃退火进行反应。对比不同条件下的反应结果，确定最终反应体系与反应条件。

1.4.2 标准曲线的建立 选取(3.88×102)～(3.88×108) 拷贝/μL的标准质粒作为模板，同时设置阴性对照(以ddH2O代替模板)，采用1.4.1节优化的反应体系与反应条件进行RT-qPCR扩增，以读取的循环阈值(Ct)为y轴，以标准质粒含量(拷贝/μL)的常用对数值为x轴，绘制Ct与质粒含量的标准曲线。

1.4.3 敏感性试验 分别用(3.88×100)～(3.88×109) 拷贝/μL的质粒作为模板，采用1.4.1节优化的反应体系与反应条件进行试验，测定该方法敏感性。同时进行普通PCR敏感性测定。

1.4.4 特异性试验 按照1.4.1节建立的反应体系，分别以PEDV、PDCoV、TGEV和PRRSV核酸为模板，同时设3.88×105拷贝/μL的标准质粒为阳性对照，ddH2O代替模板处理为阴性对照，进行TaqMan RT-qPCR扩增，重复2次，检验该方法的特异性。

1.4.5 重复性试验 分别选取3.88×102，3.88×105，3.88×108拷贝/μL的标准质粒作为模板，进行3次批内与批间TaqMan RT-qPCR反应，根据每次试验的Ct值计算变异系数，验证该方法的重复性。

1.5 临床样品的检测

应用本研究建立的TaqMan RT-qPCR方法，对2018-2019年收集自河南部分地区猪场的83份样品进行检测，同时进行普通PCR检测，验证该方法的临床应用效果。

2 结果与分析

2.1 PSV TaqMan RT-qPCR反应体系和条件的优化

经过对引物、探针用量和退火温度的优化，最终确定RT-qPCR反应体系如下：Premix ExTaqTM12.5 μL，引物F2和R2各0.5 μL，探针P 1 μL，cDNA模板3 μL，去离子水7.5 μL。最佳反应条件为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。

2.2 PSV TaqMan RT-qPCR标准曲线的建立

Ct值(y)与标准质粒含量(拷贝/μL)的常用对数值(x)的回归方程为y=-3.515x+41.808，相关系数R2为0.998(图1)，表明Ct值与倍比稀释的标准质粒之间具有良好的线性关系。

图1 PSV TaqMan RT-qPCR标准曲线Fig.1 Standard curve of PSV TaqMan RT-qPCR

2.3 PSV TaqMan RT-qPCR检测方法的敏感性

用建立的TaqMan RT-qPCR方法对(3.88×100)～(3.88×109) 拷贝/μL的标准质粒进行试验。结果显示,该方法对标准质粒的检测下限为3.88×101拷贝/μL(图2)，而普通PCR的检测下限为3.88×103拷贝/μL(图3)。结果表明，TaqMan RT-qPCR的敏感性是普通PCR的100倍。

1～9.分别为(3.88×109)～(3.88×101) 拷贝/μL标准质粒的扩增结果1-9.Amplification of standard plasmids (3.88×109)-(3.88×101) copies/μL

M.DNA Maker BM 2000+；1～9.依次为(3.88×109)～(3.88×101) 拷贝/μL标准质粒的扩增结果；10.阴性对照M.DNA Maker BM 2000+;1-9.Amplification of standard plasmids (3.88×109)-(3.88×101) copies/μL;10.Negative control

2.4 PSV TaqMan RT-qPCR检测方法的特异性

特异性试验结果(图4)表明，除阳性对照之外，PEDV、PDCoV、TGEV和PRRSV的扩增结果均呈阴性，说明该方法能够检测出PSV，而不与其他病毒(PEDV、PDCoV、TGEV和PRRSV)出现交叉反应，具有良好的特异性。

图4 PSV TaqMan RT-qPCR检测方法的特异性试验(以TGEV为例)Fig.4 Specificity test of PSV TaqMan RT-qPCR method (TGEV as example)

2.5 PSV TaqMan RT-qPCR检测方法的重复性

分别以3.88×102，3.88×105，3.88×108拷贝/μL的标准质粒作为模板进行重复性试验，结果显示批内与批间Ct值的变异系数均小于1.0%(表2)，表明该方法的重复性较好。

表2 PSV TaqMan RT-qPCR检测方法的重复性Table 2 Reproducibility test of PSV TaqMan RT-qPCR method

2.6 临床样品检测

PSVTaqMan RT-qPCR方法对83份临床样本的检测结果显示，PSV阳性样品有31份，检出率为37.3%(31/83)，其中粪便阳性样品22份， PSV含量为(2.1×103)～(8.5×104) 拷贝/μL；肠道阳性样品9份， PSV含量为(3.7×102)～(8.7×103) 拷贝/μL。普通PCR方法检测呈阳性的样品有10份(粪便阳性样品7份，肠道阳性样品3份)，检出率为12.0%(10/83)，检出率明显低于TaqMan RT-qPCR方法。普通PCR检测呈阳性的样品，TaqMan RT-qPCR方法检测也均呈阳性。随机选取3份TaqMan RT-qPCR方法阳性而普通PCR方法检测阴性的样本进行测序鉴定，结果呈PSV阳性，表明本研究建立的方法检出率高，准确性好，可用于PSV的临床流行病学调查。

3 讨 论

PSV主要感染家猪和野猪，对任何年龄段的猪均有感染性，特别是断奶仔猪更易受到该病毒的感染[12-13]，是引起猪肠炎、肺炎、脑脊髓灰质炎和繁殖障碍等症状的重要病原体[14]。近年来，PSV在猪群中的感染呈上升趋势，且易与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪捷申病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等发生混合感染[15-16]，造成感染猪出现严重的临床症状，康复猪持续带毒，怀孕母猪流产或产死胎，给养猪业带来巨大的经济损失[17]。

PSV的检测方法有病毒分离鉴定[18]、普通RT-PCR[2]、荧光定量PCR[17,19]、环介导扩增等温[20]和ELISA[21]等技术。病毒分离是传统的鉴定方法之一[22-23]，Lan等[5]分离了中国第一株猪萨佩罗病毒，并通过电镜观察到病毒的外部结构，但是该方法耗时长、需要无菌环境，对临床快速诊断有一定局限性；普通PCR可应用于大量样本的检测，检测成本较低，但不能对病原进行定量检测，且不适用于病毒的早期诊断。环介导扩增等温技术是一种新兴的基因扩增技术，采用恒温在较短时间就可实现核酸扩增，并且无需后续的核酸凝胶电泳等过程，简化了试验过程，避免了可能出现的操作污染的发生[24]。ELISA方法利用抗原抗体特异性结合的特点对病毒进行检测，但是抗体制备花费时间较长，因此也不能及时有效地用于临床诊断。

实时荧光定量PCR方法是基于SYBR Green Ⅱ和探针法的一种检测方法,目前被广泛应用于病原的早期检测及流行病学调查[25],由于其灵敏度较高，特异性较强，而且能够定量检测样品中的核酸含量，成为目前在临床检测上最准确的方法之一[26]。TaqMan探针法既实现了PCR对核酸的高效扩增，规避了普通PCR技术因核酸含量低造成的漏检，又具有特异性强和灵敏性高的优点[27]。郭博等[17]建立的PSV SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法，检测下限为6.37×102拷贝/μL，而本研究建立的TaqMan RT-qPCR检测方法检测下限为3.88×101拷贝/μL,相较于前者来说，灵敏度更高。

郭博等[17]采用SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法对四川省部分地区的58份猪腹泻粪便进行检测，阳性率为56.9%。孙杰等[21]采用ELISA方法对2016年采自江苏省6个不同地区猪场的281份临床血清样品进行了检测，PSV抗体阳性率为38.43%。本研究对83份临床样品进行PSV检测，结果显示，阳性率为37.3%(31/83)，说明PSV在中国的猪场已经普遍存在，需要引起重视。

本研究建立的PSVTaqMan实时荧光定量PCR方法，对PSV的流行病学调查提供了技术支撑，有利于我国猪群中PSV的监测和防控。