分枝杆菌转化甾醇过程的中心代谢关键基因转录差异分析

熊亮斌 孙吉 刘显舟 屈占国 计雨情 徐一新 王风清

（1. 上海健康医学院协同科研中心/药学院，上海 201318；2. 华东理工大学生物工程学院，上海 200237）

甾体药物是仅次于抗生素的第二大类药物，具有抗炎、抗过敏、抗病毒和神经保护［1］等众多突出功效。目前，市售甾体药物达400余种，销售额超1 000亿美元，约占全球医药总销售额的10%，我国是甾体原料药及制剂的主要供应国，产量占世界1/3以上［2］。利用分枝杆菌等微生物代谢转化低值的植物甾醇（油脂加工废料、造纸废料等的回收提取物）［3］，获得甾体药物中间体的过程，是现行甾体药物生产工艺的基础步骤。通过对分枝杆菌内源甾醇代谢途径的阻断，可获得一系列具有重要价值的甾体药物中间体转化菌株，如C19甾体（雄甾-4-烯-3，17-二酮，AD；宝丹酮，BD；9α-羟基化-雄甾 -4-烯 -3，17-二酮，9-OHAD）［4-5］和 C22 甾体（22-羟基 -23，24-去甲胆甾 -1，4-二烯 -3-酮，4-HBC）［6］等。随后，结合化学及微生物转化，可获得包括肾上腺皮质激素、孕激素等几乎所有种类的临床用甾体药物［7］。

分枝杆菌可利用甾醇作为生长及生理代谢唯一的碳和能量来源［8-9］。通常，野生型分枝杆菌可完全降解甾醇，此过程无明显的中间代谢物积累［8-9］。当阻断甾醇代谢途径后，对甾醇底物的不完全降解，将导致9-OHAD等中间代谢物的大量积累。鉴于此类中间产物可能存在的细胞毒性，此时，转化菌株的呼吸、生长及生理代谢将发生一系列的适应性反应，以应对不利的细胞内外环境［10］。然而，聚焦于分枝杆菌转化甾醇过程的中心代谢途径相关研究尚有欠缺，有必要针对性探究此过程的内在调节机制。

前期研究发现，分枝杆菌的SigD因子可能是参与甾醇代谢调节的负调控因子，删除该基因将引起甾醇途径关键酶基因的转录上调，从而在一定程度上增强菌体对甾醇的转化和目标产物积累［11-12］。此外，甾醇代谢途径缺陷型的分枝杆菌，在以甾醇为唯一碳源时，无法正常生长；而当同时存在葡萄糖和甾醇时，其细胞生长和代谢甾醇的能力均可迅速恢复，此现象表明分枝杆菌生理代谢调控机制的复杂性。本研究选取可转化甾醇积累9-OHAD的工程菌株，利用转录组测序结合qRT-PCR技术，分析中心代谢相关基因的转录水平变化，通过测定在甾醇转化过程的糖代谢速率变化趋势，初步揭示分枝杆菌的适应性代谢调节规律，以期为后续工程菌株的升级改造提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株质粒及引物 本研究所涉及的菌株及质粒如表1所示。新金分枝杆菌Mycobacterium neoaurum ATCC 25795（Mn）购自美国国家菌种保藏中心。9-OHAD初始生产菌株（MnΔkstD1）均由本实验室姚抗等［4］构建。用于质粒转化扩增的大肠杆菌Escherichia coli DH5α购自天根生化科技（北京）有限公司。本研究用于构建自杀质粒的p2NIL及pGOAL19质粒，为英国传染病研究所的T. Parish博士惠赠。本研究使用的引物如表2所示。

表1 本研究涉及的菌株及质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究涉及的引物Table 2 Primers used in this study

1.1.2 培养基 LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母提取物 5 g/L。基本培养基：NH4NO32 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，柠檬酸铁铵 0.05 g/L，pH 7.5。种子培养基：甘油 20 g/L，柠檬酸 2.0 g/L，NH4NO32.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，柠檬酸铁铵 0.05 g/L，pH 7.5。发酵培养基：葡萄糖10 g/L，柠檬酸2 g/L，NH4NO32 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，柠檬酸铁铵0.05 g/L，pH 7.5。

1.2 方法

1.2.1 培养条件 大肠杆菌DH5α接种于5 mL LB培养基，37℃，220 r/min振荡培养，按需求加入卡那霉素（50 μg/mL）或潮霉素（50 μg/mL）。分枝杆菌的培养：首先，取甘油菌或挑取单克隆，接种于5 mL LB培养基，30℃，220 r/min振荡培养至OD600= 1.2-1.8；随后，按1∶10（V/V）接种于30 mL种子培养基，培养至OD600= 1.2-1.8。如需进行表型鉴定，可取种子培养液，按1∶10（V/V）接种于基本培养基，再添加无菌葡萄糖、胆固醇或植物甾醇。如需进行甾醇转化测定，则取种子培养液，按1∶10（V/V）接种于发酵培养基，同时添加无菌植物甾醇。

1.2.2 kstD1敲除菌株的构建 本菌株由姚抗等［4］构建，大致流程如下：（1）引物设计（表2）。在M.neoaurum ATCC 25795基 因 组（GenBank Accession No. NZ_JMDW00000000.1）查找定位kstD1基因的位 置（GenBank：NZ_JMDW01000019.1 Region：123054…121522，1 533 bp），分别设计上游同源臂引物D-kstD1-UF & D-kstD1-UR，下游同源臂引物D-kstD1-DF & D-kstD1-DR。（2）同源臂扩增。利用高保真PrimerSTAR Max DNA聚合酶（宝生物工程有限公司），以新金分枝杆菌Mn总基因组为模板，进行PCR扩增；随后，采用PCR产物纯化试剂盒回收，获得上下游同源臂。（3）同源臂及p2NIL质粒酶切。分别利用Hind III & Pst I或Pst I & Kpn I双内切酶体系，对上下游同源臂纯化产物进行酶切；同时，利用Hind III & Kpn I酶切p2NIL质粒提取物。（4）构建p2NIL-同源臂重组质粒。利用T4 DNA连接酶连接p2NIL及上下游同源臂的酶切产物，获得重组质粒，转化DH5α感受态，以D-kstD1-UF & D-kstD1-DR验证获得阳性克隆。（5）构建pGOAL19-同源臂重组质粒。利用Pac I酶切pGOAL19质粒提取物，凝胶电泳回收分子量较大的酶切条带（7 949 bp）；同时，利用Pac I酶切p2NIL-同源臂重组质粒提取物，纯化回收；随后，利用T4 DNA连接酶连接，获得自杀质粒p19-kstD1，转化DH5α感受态，筛选获得阳性克隆，即为可用于kstD1基因删除的自杀质粒。采用电转化的方式，将自杀质粒转入分枝杆菌感受态细胞，通过两步筛选获得kstD1基因缺失的菌株［13］。

1.2.3 转化能力评估［11］按1.2.1方法准备种子培养液，转接发酵培养基，测试kstD1基因缺失菌株转化甾醇积累9-OHAD的能力。培养条件为30℃，220 r/min，培养时间120 h，每隔24 h取样500 μL。待取样完毕，以500 μL乙酸乙酯振荡萃取，12 000× g，离心10 min。取上层萃取液，可用于薄层色谱法（TLC）分析；展开剂为石油醚∶乙酸乙酯 =6∶4，跑板后风干，以20%稀硫酸喷淋表面，随后置于105℃烘箱，显色约6-8 min。高效液相色谱（HPLC）分析：取上层萃取液，置于1.5 mL离心管风干，加入HPLC级甲醇重溶，12 000 × g，离心10 min，以0.22 μm微孔滤膜过滤，即可用于HPLC分析。HPLC参数如下：色谱柱Agilent XDB-C18（250 mm × 4.6 mm），进样体积10 μL，流动相为甲醇∶水 = 8∶2，流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长254 nm。

1.2.4 RNA提取、转录组测序及qRT-PCR分析［11］分枝杆菌总RNA的提取步骤按FastRNA Pro Blue RNA试剂盒，及FastPrep-24 样品处理系统（MP Biomedicals，美国）说明书进行。利用FastQuant cDNA试剂盒（天根生化科技有限公司，北京），对提取的RNA进行反转录；采用Quant one step qRTPCR Kit（SYBR Green）（天根生化科技有限公司，北京）进行qRT-PCR分析实验。菌株发酵转化条件下培养24 h取样，收集约含1010个细胞的培养液（OD600= 1.0，细胞浓度约为1 × 109cells/mL，此时取10 mL培养液，细胞数约为1010个；若OD600= 2.0，则需取5 mL培养液，细胞数约为1010个，依此类推），4 000×g，4℃离心15 min，收集菌体。随后，按试剂盒说明书步骤，进行破菌，提取总RNA，去除cDNA，反转录，送上海华大基因科技有限公司测序，或开展qRT-PCR分析。

1.2.5 葡萄糖含量的测定 按葡萄糖含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）说明书要求，稍加调整测定培养液残留葡萄糖浓度。取培养液1 mL，离心收集上清，按20 μL样品液，20 μL试剂一、160 μL试剂二和试剂三的混合液（即用即配，1∶1比例混合）配制测定体系；同时，设置阳性对照和阴性对照，此外，利用试剂盒中的葡萄糖标准品配制标准曲线测定孔。随后，将混合液放入37℃静置孵育15 min，于505 nm波长读取吸光度值。

2 结果

2.1 缺失kstD1基因的9-OHAD初始生产菌株构建结果

基于同源重组无标记删除技术，利用目的基因上游同源臂正向引物D-kstD1-UF和下游同源臂反向引物D-kstD1-DR，进行PCR扩增验证。结果如图1-A所示，标记为Mn的泳道则为未发生同源重组的原始菌株PCR扩增结果，而标记为MnΔk1的泳道即为缺失kstD1基因的分枝杆菌菌株PCR扩增结果。随后，采用发酵转化评估显示，所获得的MnΔk1菌株，具有转化甾醇积累9-OHAD中间产物的能力（图 1-B）。

图1 删除kstD1基因的分枝杆菌PCR验证及转化甾醇结果Fig. 1 Effect of deleting kstD1 on the Mycobacterium PCR verification and biotransformation of sterols

2.2 中心代谢相关基因的转录分析

为研究分枝杆菌在代谢甾醇积累甾体药物中间体时，转化菌株的糖酵解、磷酸戊糖等中心代谢途径的响应调节机制。利用上述步骤获得具有代表性的9-OHAD转化菌株MnΔk1，在添加1 g/L甾醇底物的条件下培养转化24 h，分析测定其与野生型菌株的转录差异情况。

结果显示，（1）在野生型菌株添加甾醇时，如采用转录上调或下调2倍为阈值（Log2值≥1或≤-1），分别有琥珀酸脱氢酶复合体D亚基的编码基因sdhD（2.63），琥珀酸脱氢酶复合体C亚基sdhC（2.52），琥珀酰辅酶A合成酶β亚基sucC（1.25）和果糖-1，6-二磷酸酶glpX（1.13）等出现明显的转录上调；另有6-磷酸果糖激酶pfkB（-2.85），乌头酸酶acn（-1.15），柠檬酸合酶citA（-1.14）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwf（-1.12）等出现显著的转录下调（图2-A）。（2）当MnΔk1菌株转化甾醇积累9-OHAD产物时，我们注意到琥珀酰辅酶A合成酶α亚基sucD，琥珀酸脱氢酶复合体A亚基sdhA，琥珀酸脱氢酶复合体B亚基sdhB，苹果酸合酶glcB等基因的转录水平出现进一步上调，相对野生型菌株，分别提高2.10、1.48、1.29和1.17（图2-B）。上述结果表明，缺失kstD1的分枝杆菌菌株在转化甾醇积累9-OHAD过程中，中心代谢途径相关基因的转录出现规律性转录扰动。

图2 分枝杆菌转化甾醇过程中心代谢相关基因的转录对比分析Fig. 2 Transcriptional comparisons of genes related in central metabolism pathways during the sterol transformation in Mycobacterium

2.3 中心代谢限速步骤关键基因转录水平的qRTPCR验证

为确认MnΔk1菌株在转化甾醇积累甾体药物中间体的过程中，中心代谢限速步骤关键基因的转录水平变化趋势，随后按发酵转化条件培养菌体，于24 h取样提取总RNA，根据16s rRNA序列设计内参引物，分析了中心代谢途径关键基因的转录水平变化。

结果如图3所示，除未定位到的关键基因之外，在9-OHAD生产菌株MnΔk1中，糖酵解途径的6-磷酸果糖激酶pfkB基因（下调1.96倍），丙酮酸激酶pyk基因（下调1.49倍）；磷酸戊糖途径的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwf基因（下调3.57倍），6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶gntZ基因（下调2.43倍）；三羧酸循环的柠檬酸合酶citA基因（下调2.5倍），异柠檬酸脱氢酶icd2基因（下调1.78倍），酮戊二酸脱氢酶kdg基因（下调1.92倍）等限速步骤关键基因，均出现了较为明显的转录下调。

图3 中心代谢关键基因转录的qRT-PCR分析结果Fig 3 qRT-PCR analysis of key genes in central metabolism

2.4 甾醇转化过程中葡萄糖代谢速率的变化测定

为评估转化甾醇过程中分枝杆菌对葡萄糖的代谢情况，我们测定了单位湿重菌体的葡萄糖消耗速率。结果如图4所示，相对野生型Mn菌株，MnΔk1菌株对葡萄糖的利用速率分别低64.9%（24 h）和19.8%（48 h）。随着转化时间的延长，在发酵体系中，葡萄糖消耗殆尽，葡萄糖代谢速率逐渐趋于零。

图4 分枝杆菌转化甾醇过程的葡萄糖代谢速率变化Fig. 4 Metabolic rate of glucose during the sterol bioconversion in Mycobacterium

3 讨论

分枝杆菌遭遇不良的外环境时，菌体内的众多调控基因可迅速响应pH、溶氧、离子浓度等压力胁迫，通过调整自身的营养代谢或表面结构等，以适应外环境的剧烈变化［14-17］。例如，酸性环境可使分枝杆菌生长明显减缓，而如果对其中的双组分调控系统PhoP-PhoR进行功能删除，菌体内部发生代谢重构，又可部分恢复正常的生理代谢功能［18］。分枝杆菌代谢甾醇获得甾体药物中间体的反应过程，关键限速步骤在于菌体内源代谢途径对底物的转化效率。通过强化途径关键酶基因的表达，理论上可改善菌体对底物的转化［11，19］。然而，由于甾体中间产物可能存在的细胞毒性，大量积累甾体药物中间体的过程，正是形成负反馈抑制菌体生理代谢的不利因素之一［10］，菌体很可能通过减弱呼吸代谢等一系列适应性调节机制，以降低对外环境物质和能量的交换，然而此类适应性调节机制很可能对底物转化速率产生负面影响，从而降低了目标产物的积累效率。

本研究集中分析了9-OHAD的转化菌株MnΔk1，在代谢甾醇积累中间体过程的中心代谢相关基因转录差异变化。结果显示，在菌株转化甾醇积累9-OHAD中间体的中前期，糖酵解途径、磷酸戊糖途径和三羧酸循环限速步骤的关键基因，出现普遍的转录下调，表明在葡萄糖和甾醇同时存在的转化阶段，MnΔk1菌株对前者的利用很可能受其内在调控机制作用而受到一定程度的抑制。此阶段，菌体很可能通过抑制中心代谢途径的效率，降低细胞的基础代谢，以减弱甾体药物相关中间体积累对细胞造成的压力（图5）。随后，通过对葡萄糖消耗速率的测定，在发酵转化的前期，MnΔk1菌株对葡萄糖的平均消耗速率明显低于Mn菌株；而在转化阶段的中后期，由于葡萄糖消耗殆尽，菌体对葡萄糖的消耗速率也逐渐趋于接近，说明在复合碳源条件下，分枝杆菌很可能存在一些适应性调控机制，以应对胞外不断变化的复杂外环境。

图5 分枝杆菌甾醇代谢与中心代谢途径的关联简图Fig. 5 Schematic diagram of sterol metabolism pathway and central metabolism pathway in Mycobacterium

4 结论

本研究以新金色分枝杆菌Mycobacterium neoaurum ATCC 25795为研究对象，通过同源重组删除kstD1基因，获得可转化甾醇积累甾体药物中间体9-OHAD的工程菌株。分枝杆菌在转化积累目标甾药中间体时，中心代谢途径限速步骤的关键基因在转录水平受到明显的抑制性调控，揭示了分枝杆菌转化甾醇过程的适应性调节机制。