低咖啡碱茶树育种研究进展

梁少茹，王晓，党永超，付群英，赵丰华

（1.信阳市农业科学院，河南 信阳 464000；2.河南省豫南茶树资源综合开发重点实验室，河南 信阳 464000）

咖啡碱（caffeine）是茶叶的特征物质之一，同时也是重要的滋味物质。茶叶咖啡碱含量通常在3%～5%之间，也常被看作是影响茶叶质量的一个重要因素。咖啡碱具有升高血压、增加血液中的儿茶酚胺含量、增强血液中高血压蛋白原酶的活力、提高血清中游离脂肪酸水平、利尿和增加胃酸的分泌等作用［1］。一般来讲，正常人日常饮茶所摄入的咖啡碱含量，即使按茶叶含量最高值计算也在安全范围之内。然而，由于咖啡碱的药理功能，摄入过量会引起焦燥不安、失眠、血压升高等症状，对人体健康产生不利影响。经研究，摄入过多咖啡碱，易诱发儿童多动症［2］，诱发孕妇妊娠中毒症并导致新生儿残疾、使胃溃疡患者溃疡难于愈合、更年期妇女月经紊乱、中老年人缺钙甚至骨质疏松［3］，诱发脑血栓或心肌梗塞［4］，引起高血压和心率不齐［5-7］等不良反应。因此，部分人群如儿童、孕妇、更年期妇女、中老年人、胃溃疡、心脑血管、神经衰弱及高血压等疾病患者不适宜摄入。

目前日本、美国等一些国家对茶制品中咖啡碱含量已作出限量规定，但对低咖啡碱茶中咖啡碱含量没有统一标准，欧美等一般要求咖啡碱含量低于0.5%，中国、日本将咖啡碱含量低于1%的茶叶称为低咖啡碱茶［8，9］。为了满足特殊人群的需求，近年来各类低咖啡碱茶的研究也越来越引起研究者的兴趣。降低茶叶中的咖啡碱含量目前主要从两个方面来进行：一是通过一定的加工工艺，利用物理化学等手段脱除茶叶中的咖啡碱；另一条途径是进行茶树育种研究，培育出低咖啡碱含量的茶树新品种。

国内外运用物理化学等方法脱除茶叶咖啡碱的研究一直不断，如：用热水浸提法脱除茶鲜叶中的咖啡碱［10-12］，利用工业乙醇［13］、三氯甲烷［14］等有机溶剂萃取茶叶或茶提取液中的咖啡碱，或运用超临界CO2萃取［15-17］、大孔树脂吸附法［18］提取咖啡碱，此外还有减压升华法［19］、茶多酚水溶液浸提法［20］、微生物降解法［21，22］等手段降低茶叶咖啡碱含量。国内外目前也有一些咖啡碱脱除工艺和装备的专利面世［23］。然而一直以来，关于脱除茶叶咖啡碱的加工工艺研究并不深入，目前为止尚未研究出既保持茶叶原有风味又安全高效的方法。从长远看，加强茶树育种研究，培育咖啡碱含量低的茶树品种是最为有效且经济安全的方法。

低咖啡碱茶树育种的途径主要有常规育种和利用生物技术尤其是基因工程开发茶树新品种。

1 常规育种选育低咖啡碱茶树

通过常规杂交育种选育低咖啡碱茶树新品种是降低茶叶咖啡碱含量经济有效的方法之一。

1.1 低咖啡碱茶树种质资源的鉴定及评价

我国农业行业标准规定低咖啡碱茶树特异种质资源咖啡碱含量不超过1.5%［24］。选育低咖啡碱茶树品种，天然低咖啡碱茶树种质资源的筛选、鉴定及评价尤为重要。

经过一系列的研究与选择，目前已筛选出部分低（无）咖啡碱茶树种质资源。早在20世纪80年代日本就已开始低咖啡碱茶树新品系选育，并选出8份咖啡碱含量低于2%的茶树品系［25］。目前，日本等国已鉴定出咖啡碱低于0.5%的茶树育种材料［26］。我国低咖啡碱茶树资源非常丰富，科研工作者不断加大对特异种质资源的筛选力度，获得一些低咖啡碱育种材料，尤其是近年来获得了多个咖啡碱含量低于1.5%的茶树育种新材料［27］，低咖啡碱育种已经取得良好进展。

20世纪80年代，张宏达等［28］在广东龙门发现一种天然无咖啡碱的茶树品种资源即可可茶（毛叶茶），分析表明可可茶含有4.7%可可碱而不含咖啡碱；陈盛相等［29］从四川联江良种场、蒙顶山70份资源中筛选出2份咖啡碱含量春季低于2%的资源；唐一春等［9］通过对勐海国家茶树种质分圃100份茶树资源农艺性状、生化成分及加工品质的鉴定评价，筛选出2份（即金厂大树茶、大坝大树茶）咖啡碱含量分别为0.06%、0.07%的野生型特异茶树种质资源，但经分析这两种资源与国家级良种云抗10号相比经济性状、生化成分含量均较差；张凯等［30］对川渝地区野生大茶树资源进行调查研究发现1份低咖啡碱茶树资源黄山苦茶，咖啡碱含量只有0.323%；刘声传等［31］对贵州省25个县（市）境内53份树龄约100年以上的野生茶树资源的主要生化成分进行测定评价和遗传多样性分析，筛选出1份咖啡碱含量为1.8%的资源，接近低咖啡碱资源含量；苏会等［32］对豫南地区115份茶树种质资源进行遗传变异分析，其咖啡碱变异系数为28.57%，并筛选出咖啡碱含量为0.13%的种质资源1份；段志芬等［33］对云南景洪市49株野生古茶树进行低咖啡碱资源筛选，结果为低咖啡碱含量（≤1.50%）特异资源有 14 份，咖啡碱含量极低的（≤0.70%）有4份，即曼加坡坎3号大茶树、光明水库2号大茶树、大寨5号大茶树和曼加坡坎6号大茶树，占总资源数的8.16%。这些低咖啡碱特异种质资源的筛选与发现，可为选育低咖啡碱茶树品种奠定基础。

1.2 低咖啡碱茶树品种常规选育研究进展

利用已筛选出的低咖啡碱种质资源，并通过一定的育种技术研究与试验，目前低咖啡碱茶树育种已取得一些进展。

日本用筛选出的咖啡碱含量低的品种与薮北种杂交获得8个咖啡碱含量低于1.7%的单株后代，最低的为1.42%，且通过对茶树和茶树近缘种进行种间杂交试验，选育出多个咖啡碱含量在1.5%以下的单株［25］。叶创兴等［34］对毛叶茶进行育种研究，现已选出纯种的可可茶，为进行优良无性系品种选育打下基础。广东省农业科学院茶研究所和中山大学合作，以野生南昆山白毛茶为亲本杂交选育出一批可可茶新品系，其中“可可茶l号”和“可可茶2号”的咖啡碱含量几乎为零［35］。南京农业大学运用多项现代技术，杂交选育出一种低咖啡碱茶树品种“苏安特”，使茶叶中咖啡碱含量从4%左右降低为0.79%，而茶叶中原来的其它一些营养成分保持不变［36］。Ogino等［26］在“Cha Chuukanbohon Nou 6”（杂交组合Camellia taliensis×C.sinensis的后代）天然杂种中鉴定出咖啡碱含量很低但可可碱含量很高的单株2个。安徽农业大学在茶树与油茶嫁接选育低咖啡碱茶树品种研究中发现，采用地上部根颈嫁接法，以多抗香品种茶树作接穗，嫁接后的苗木中咖啡碱含量由3.08%降低到2.01%，因此可以认为茶树与油茶嫁接是降低茶树咖啡碱含量的有效方法之一［37］。

1.3 常规育种的缺点与面临的困难

常规育种选育低咖啡碱茶树品种有一些缺点与困难，使得选育新品种进展缓慢。面临的困难主要有：一是茶树属木本植物，生育周期长，常规育种需要20年左右时间，年限较长，耗费人力、物力、财力较大；二是缺乏天然可利用的优质低咖啡碱育种材料，现阶段筛选的低咖啡碱种质资源一般品质性状较差，产量较低；三是筛选的有些低咖啡碱野生种质资源与栽培茶树杂交易发生不孕或胚发育不完全现象，难以获得杂种后代，即使获得低咖啡碱杂交种，也大多品质不佳，难以大范围推广应用；四是咖啡碱含量属于数量性状，易受栽培条件、外界环境条件的变化而不稳定，需多次重复鉴定，效率较低。鉴于此，近年来，利用传统育种方法选育低咖啡碱茶树虽取得一些进展，但无论是可可茶，还是选育的其它低咖啡碱茶树资源均未获得大规模的开发利用。目前为止，还未通过常规育种选育出适应市场的高产优质品种。

2 应用基因工程降低茶树咖啡碱研究

基因工程育种是指有目的地将外源基因导入植物并使之整合、表达和遗传，修饰原有植物遗传物质、改造不良的园艺性状而进行的新品种育种方法。基因育种可以快速实现定向选择育种目标，大大缩短育种周期，利用基因工程可以在较短时间内培育低咖啡碱茶树，而且不会影响转基因植株的其它生化成分，因此利用基因工程来培育低咖啡碱茶树品种是一条新途径。

2.1 茶树体内咖啡碱合成途径中相关酶的基因分离与克隆

关于咖啡碱的合成途径大多是通过对咖啡果和茶树的研究得来的，经国内外学者研究证明，咖啡碱在各种含咖啡碱植物中合成的基本路径基本一致［38］。研究者在大量研究基础上，将咖啡碱的合成途径分成两个部分：核心途径和供体途径［39］。

2.1.1 核心途径 咖啡碱合成的核心途径主要分为四个步骤，包括甲基化转移酶催化的三次甲基化作用和核糖核苷水解酶催化的一次脱核苷作用［40］，具体途径为：黄嘌呤核苷（xanthosine）→7-甲基黄嘌呤核苷（7-methylxanthosine）→7-甲基黄嘌呤（7-methylxanthine）→可可碱（theobromine）→咖啡碱［41］。N-甲基转移酶（NMT）是咖啡碱合成过程中的重要酶。

在咖啡碱合成的核心途径中，第一步甲基化反应是由7位N-甲基转移酶催化完成。Negishi等［42］从茶树叶片中获得7-NMT（黄嘌呤核苷N-甲基转移酶），并证明它是催化第一步反应的酶。Mizuno等［43］从咖啡树中克隆出该酶全长编码基因cDNA CmXRS1（AB034699），其在大肠杆菌中表达的重组蛋白显示N-甲基转移活性。第二步和第三步甲基化反应分别由3位和1位N-甲基转移酶催化完成。Suzuki等［44］从茶叶提取物中分离出这两种酶，分别催化可可碱、咖啡碱的反应生成，并证明这两种酶具有相似性质。Kato等［45，46］从茶叶嫩叶中分离出咖啡碱合成酶（CS），利用RACE技术克隆出该酶编码cDNA，TCS1（AB031280），并通过体外表达和功能验证证实TCS1为编码茶树咖啡碱合成酶的基因。

由7-甲基黄嘌呤核苷合成7-甲基黄嘌呤由核糖核苷水解酶催化完成。Negishi等［47］曾从茶树粗酶液中检测出核糖核苷水解酶的活性并纯化出部分该酶，但关于该酶的基因克隆及相关的蛋白表达未见报道。

2.1.2 供体途径 在供体途径中，有多种来源可以最终合成黄嘌呤核苷，从而为核心途径提供起始甲基受体。目前至少发现存在四条不同的合成途径，分别是：嘌呤环从头合成途径、腺嘌呤核苷酸（AMP）降解途径、鸟嘌呤核苷酸（GMP）降解途径以及S-腺苷甲硫氨酸（SAM）循环途径［39，48］。

茶树黄嘌呤核苷主要来源于S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。SAM合成酶是咖啡碱合成过程中的重要酶之一。冯艳飞等［49］首次从茶树叶片中克隆茶树S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成酶基因cDNA，sAMS（Gen Bank登录号：AJ277206，DDBJ登录号：AB041534），所得基因序列长1 303 bp，编码394个氨基酸，该基因的克隆为今后咖啡碱代谢的调控研究奠定了基础。IMPDH（次黄嘌呤核苷酸脱氢酶）是催化次黄嘌呤核苷酸（IMP）转化为黄嘌呤核苷酸（XMP）的关键酶。Keya等［50］首次克隆得到IMPDH基因编码cDNA，TIDH（EU106658），并证明其在咖啡碱合成途径中起关键作用。AMP脱氨酶催化腺嘌呤核苷酸（AMP）→次黄嘌呤核苷酸（IMP）反应。魏艳丽等［51］首次通过从茶树全器官转录组文库中获得的AMP脱氨酶的部分EST序列成功克隆出茶树AMP脱氨酶cDNA的全长（GenBank登录号：AGJ84350.1），通过对不同物种的AMP脱氨酶氨基酸比对发现，茶树的AMP脱氨酶与其它植物克隆出的AMP脱氨酶基因有较高的同源性，并含有相似的蛋白质保守活性位点。

目前，催化黄嘌呤核苷酸（XMP）→xanthosine（黄嘌呤核苷）的核苷酸酶、鸟嘌呤脱氨酶（guanine deaminase，GDA）在茶树叶片中也已被检测到［52，53］，但是关于它们完整的基因序列还没有相关报道。

2.2 茶树体内咖啡碱合成途径中相关酶及基因研究利用

根据已获得的咖啡碱合成途径中相关酶的基因序列信息，不同地区研究者已展开一系列研究与探讨。

余有本［54］从龙井43中克隆了茶树咖啡碱合成酶的cDNA编码区序列及cDNA全长序列；李远华等［55］采用原位杂交技术研究，结果表明茶树咖啡碱合成酶基因（TCS1）mRNA表达主要存在于含叶绿体多的栅栏组织。陈丽萍等［56］在红山茶、油茶和可可茶基因组中PCR扩增TCS1部分片断，结果仅在可可茶中获得目的片断，并推测其核苷酸序列的差异可能是导致南昆山毛叶茶NMT基因活性改变、影响茶树体内咖啡碱代谢的原因之一；许煜华等［57］在英红9号中分离出12条核苷酸序列高度相似的NMTs；金基强等［58］利用长片段PCR法和侧翼序列克隆技术分离了白叶一号多个NMTs的基因组DNA（gDNA）全长并初步明确了它们的基因结构和序列差异。这些研究表明茶树存在着一个与嘌呤碱合成相关的NMT基因家族。李金等［59］研究10个茶树品种咖啡碱合成途径中3个关键酶基因（TCS1、TIDH、SAMS）秋季的表达量，并与咖啡碱含量进行相关性分析，结果表明，与TIDH、SAMS相比，TCS1对茶树咖啡碱的合成起到更为重要的作用。周晨阳等［60］对茶树TIDH DNA序列进行了克隆，在检测95份茶树核心种质资源的TIDH核苷酸多态性及咖啡碱含量后进行关联分析，找到2个与咖啡碱含量显著相关的单核苷酸多态（single nucleotide polymorphism，SNP）位点；魏艳丽［61］用检测48个茶树品种得到的TCS1序列进行单核苷酸多态性与对应的咖啡碱含量关联分析，发现995位点AA与CC基因型对应的咖啡碱含量存在显著差异（P＜0.05），该位点的CC基因型为低咖啡碱茶树品种的优势基因。刘玉飞等［62］对673份茶树资源的TCS1等位变异进行鉴定，克隆了一个新的TCS1稀有等位变异TCS1g，其在“龙陵17”中具有一定的表达水平且其表达蛋白仅具有可可碱合成酶活性，推测决定TCS1g仅具有可可碱合成酶活性的关键位点是第221位氨基酸残基。这些研究可为今后从基因组水平揭示不同资源间咖啡碱合成代谢差异的机理、利用特定基因选择低咖啡碱茶树种质资源、分子标记辅助育种等奠定基础。

2.3 基因工程在低咖啡碱茶树育种中的探索应用

目前，咖啡碱合成过程中重要相关酶如咖啡碱合成酶、SAM合成酶、次黄嘌呤核苷酸脱氢酶等基因的全长cDNA序列已被克隆，不同地区研究者试图通过基因工程来培育低咖啡碱茶树并进行一些探究。

反义RNA技术和RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术在植物基因工程育种中得到广泛应用，利用反义RNA技术和RNAi技术可以通过定向抑制咖啡碱合成过程关键酶基因的表达来培育低咖啡碱茶树品种。目前，其它植物已有通过该技术获得转基因植株来降低咖啡碱含量的报道。Ogita等［63］利用RNAi技术成功构建了咖啡的转基因植株，并证实转基因植株咖啡中可可碱合成酶CaXMT1和咖啡碱合成酶CaDXMT1基因的表达均受到抑制，从而使可可碱和咖啡碱合成量有所下降。张广辉等［64］成功构建了茶树咖啡因合成酶基因RNA干涉表达载体。余有本［54］构建了茶树咖啡碱合成酶基因反义RNA的表达载体和RNAi表达载体，并通过农杆菌叶盘转化法导入到了茶树愈伤组织，经鉴定TCS反义基因已整合到抗性愈伤组织的基因组中并得到正常表达。石冠华［65］构建了咖啡碱合成酶基因干涉表达载体，以龙井-43组培苗叶片为转化受体，通过根癌农杆菌将其导入植物组织中，并优化了根癌农杆菌转化茶树叶片组织的条件。Mohanpuria等［66，67］将含咖啡碱合成酶基因（CS）片段的RNAi载体分别导入茶树子叶的胚性愈伤组织和种子萌发一个月的茶树幼苗根系，成功获得含该载体的转基因植株，经测定转基因植株的咖啡碱和可可碱含量分别比对照低44%～61%和46%～67%。这证实了利用基因工程技术降低茶树咖啡碱的可能性及基因沉默的稳定性。

2.4 基因工程在茶树育种中所面临的难题

基因工程为低咖啡碱茶树育种开辟了新途径，但距离获得理想的茶树新品种还有大量的工作要做。

目前，茶树遗传转化领域技术并不成熟。农杆菌、基因枪等方法单独或联合介导的茶树遗传转化均有不少研究，但获得转基因茶树却依然非常困难。由于茶树是多年生植物，茶树中多酚类物质含量高，造成培养时愈伤组织易褐化、难以分化，转基因低咖啡碱茶树研究长期以来停留在载体构建和转化后抗性愈伤组织筛选的阶段。总的来说，迄今为止还未建立起完善的茶树遗传转化体系，这也是基因工程在茶树育种中的瓶颈问题。

此外，利用反义RNA技术和RNA干扰技术通过目前已知的咖啡碱合成关键酶基因进行探索与研究，虽然有些试验基因的表达得到抑制，转基因植株中咖啡碱含量也有所降低，但效果不够理想。现阶段茶树体内咖啡碱合成过程相关酶类的编码基因并未完全获得，每种酶类所起到的作用也并为研究透彻，咖啡碱在茶树体内的合成与分解、运输机制并未完全了解，因此获得其余关键酶的编码基因对低咖啡碱茶树育种有重要影响。

3 低咖啡碱茶树育种展望

我国茶树种质资源丰富多样，近年来各地研究者对低咖啡碱茶树种质资源考察收集、保存、保护和鉴定取得一定进展，但距离培育出理想的低咖啡碱茶树品种还有很长的路要走。在今后工作中，继续加强优异低咖啡碱茶树种质资源的收集与优良基因的鉴定，并利用现代手段从中发掘咖啡碱合成酶稀有等位基因资源，探析其遗传机制，能够为茶树新品种选育、茶树遗传改良提供物质基础与理论依据；同时应把现代分子育种与常规育种相结合，缩短育种年限，提高育种效率。

目前，与咖啡碱合成相关酶的基因克隆取得很大进展，但仍有酶类基因编码并未获得，因此有必要开展研究掌握更多的基因信息，进而更加深入研究咖啡碱代谢机制与遗传机制；可运用关联分析研究，寻找与咖啡碱含量具有紧密遗传连锁的分子标记探究茶树咖啡碱含量的影响因素；用现代技术手段明确其咖啡碱合成过程中酶的基因结构和核苷酸变异，从基因组水平剖析茶树咖啡碱的遗传机制，为茶树低咖啡碱育种奠定基础。此外，积极开展茶树遗传转化体系的研究，建立能够稳定遗传亲本优良特性的高效的茶树遗传转化体系，也是开展利用基因工程培育低咖啡碱茶树必须解决的难题。

除此之外，采用人工诱导突变创造低咖啡碱突变体，结合生化标记和分子标记技术进行辅助育种，也是低咖啡碱茶树育种的重要思路与方法。