小反刍兽疫病毒芯片式数字PCR检测方法的建立及应用

杨鸣发，马云云，于志亚，刘家森，康洪涛，姜 骞，曲连东

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室/自然疫源性人畜共患病团队，黑龙江哈尔滨 150001；2.东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨 150030）

小反刍兽疫（peste des petits，PPR）是由副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一种急性烈性传染病，在我国和许多国家都有报道，可导致绵羊和山羊出现急性发热、眼鼻分泌物增多、口腔炎症、腹泻和肺炎等症状[1]。PPRV 基因组全长为15 948 nt，为不分节段的单股负链RNA 病毒，其6 种基因编码的8 种蛋白分别为N-P（C/V）-M-F-H-L。其中，N 蛋白为病毒核蛋白，是含量最高的编码蛋白，具有保护病毒RNA 免受核糖核酸酶I 破坏的功能，与RNA 结合作为病毒转录的模板[2]。PPRV于2007 年首次在我国被发现[3]。PPRV 宿主范围广，可感染包括山羊和绵羊在内的多种小反刍动物，野生动物亦可感染，骆驼和水牛也有被PPRV 感染的报道[4]。对于PPR 的诊断方法目前以病毒分离鉴定、中和试验及实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）为主。前两种方法所需时间较长，不适于PPR 的快速诊断，而RT-qPCR 具有敏感性高、特异性强、检测时间短、无须核酸电泳等优点，是传统PCR不能比拟的。相比于RT-qPCR，芯片式数字PCR（chip-based digital polymerase chain reaction，cdPCR）在单分子层面上的检测为绝对定量，可以彻底摆脱对标准曲线的依赖而直接给出靶序列的拷贝数，从而提高了试验结果在批内和批间的稳定性，甚至能用来对标准品进行定标。cdPCR 已经实现了高通量样品条件下的自动化操作，同时可以从大量样品中直接定量核酸，更适合复杂背景中的突变检测和高污染样品中的核酸定量，从而提高核酸检测的准确性和灵敏度[5-6]。为此，本研究以PPRV-N基因的保守区域序列为研究对象，采用cdPCR 技术进行PPRV 检测，并通过优化反应条件及特异性、敏感性、重复性等一系列试验，初步建立了PPRV cdPCR 检测方法。该方法具有高通量、绝对定量、快速、简便、特异性强、重复性好、灵敏度高等优点，从而为PPR 的早期诊断、流行病学调查和检验检疫提供了高效检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

PPRV Nigeria75/1 疫苗株核酸，由中国动物卫生与流行病中心馈赠；犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、山羊痘 病 毒（goatpox virus，GTPV）、副流感病毒5 型（parainfluenza virus 5，PIV5）和口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）等核酸，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（CAAS-HVRI）兽医生物技术国家重点实验室/自然疫源性人畜共患病团队保存。用于检测的绵羊和山羊临床样本47 份，储存时间为2016—2017年，均由本实验室灭活处理保存。

QuantStudio™3D 数字PCR 仪和QuantStudio™3 和5 荧光定量PCR 仪，均购自美国赛默飞公司。QuantStudio™ 3D 数 字PCR Master Mix，产自Thermo Fisher（美国）；AxyPrepTM质粒提取试剂盒，产自QIAGEN（德国）；SuperScript III/PlatinumTaqOne-step RT-PCR Kit、MLV 反转录酶、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit 胶回收试剂盒，均购自Takara 公司。

1.2 引物和探针

应 用MegAlign 软件对GenBank 中所有的PPRV 全基因组序列进行比对，选取N基因中特异性编码区保守序列设计引物和探针。利用Primer Premier 6 对设计的引物（PPRV-N-F：CTCGGAAATCGCCTCACAGAC；PPRV-N-R：CAAATGGGTCCGAAGGAAGG）进行分析，预期扩增片段大小为166 bp，探针序列为FAMCGCCTACACCAGCGACCAGAGAAGAAG-BHQ（探针5'端标记荧光基团FAM，3'端标记荧光淬灭基团BHQ）。所有引物和探针均由吉林库美生物科技有限公司合成。

1.3 标准品制备与稀释

采用反转录试剂盒添加M-MLV 逆转录酶，以上游引物反转录合成cDNA。对利用PPRV Nigeria 75/1 疫苗毒株设计的N基因引物进行序列扩增，扩增产物预期大小为166 bp；使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit，将PCR产物连接至pMDTM18-T 载体，得到重组质粒pMDTM18-N。使用分光光度计测定标准质粒浓度。质粒浓度计算公式为

本研究标准质粒浓度为1.22×1012copies/μL，相对分子质量为58 040 g/mol。用ddH2O 将标准质粒进行10 倍系列稀释，共11 个稀释度（1.22×1012～1.22×102copies/μL），以此构建RTqPCR 标准曲线。

1.4 cdPCR 反应体系和条件优化

在QuantStudio™ 3D 数 字PCR 仪上进行cdPCR。配制反应混合液体系：3D Digital PCR Master Mix 7.5 μL，上下游引物各1.0 μL，探针1.0 μL，ddH2O 1.5 μL，cDNA 模 板3.0 μL，最终体 积 为15.0 μL。将固态芯片放在固定器上，吸取配制好的反应液均匀滴涂在芯片上，然后将芯片插入加载器上紫外胶连，插入后15 s，取出芯片。将芯片放入QuantStudio 3D Digital PCR Instrument 仪进行扩增。扩增条件：96 ℃ 10 min；60 ℃ 2 min，98 ℃30 s，39 个循环；60 ℃ 2 min，4 ℃ 60 min。扩增完成后，利用QuantStudio™ 3D AnalysisSuite™软件进行数据分析。每个样本重复试验3 次。利用QuantStudio™ 3 和5 Real time PCR 仪进行RTqPCR。反应程序：50 ℃ 10 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 1 s，60 ℃ 20 s，共40 个循环。反应总体系 为25.0 μL，其中质粒3.0 μL，SuperScript III/PlatinumTaqOne-step RT-PCR reaction mix 12.5 μL，SuperScript III/PlatinumTaqOne-step RT-PCR enzyme mix 0.5 μL，ROX 染料0.5 μL，探针（5 pmol/μL）0.5 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各1.0 μL，无核酸酶水6.0 μL。每个样本重复试验3 次。

1.5 敏感性试验

为确定检测阈值，将制备的PPRV cDNA 标准品连续作10 倍稀释（1.22×105～1.22×10-3copies/μL 9 个浓度梯度）进行cdPCR 检测，并将cdPCR 检测方法与RT-qPCR 进行比较，每个稀释度样品重复3 次。

1.6 重复性试验

分别取PPRV cDNA 标准品连续作10 倍稀释（1.22×104～1.22×100copies/μL 5 个浓度梯度）进行cdPCR 和RT-qPCR 检测，分析组间重复性，不同稀释度3 次重复，同时进行组内重复性评价。

1.7 特异性试验

利用建立的cdPCR 方法引物分别检测CDV、NDV、GTPV、FMDV、PIV5 等病毒 的DNA 或cDNA，以PPRV 标准品1.22×105copies/μL 的cDNA 作为阳性对照，ddH2O 作为阴性对照，进行特异性评价。

1.8 临床样本检测

采集2016—2017 年黑龙江省牧羊场47 份临床样本，包括肺、肠、脾、淋巴结和血液。所有临床样本提取组织RNA 反转录成cDNA 进行PPRV RT-qPCR 和cdPCR 检测，记录阳性检出率，比较两种方法的检测灵敏度。

2 结果

2.1 引物筛选及标准品构建

选取PPRVN基因编码区序列同源性和保守性较高的区域设计引物。引物序列覆盖39 株N基因编码区核苷酸（上游引物起始位点PPRVN-F：1182～1202；下游引物起始位点PPRV-N-R：1327～1347），与OIE 推荐验证的引物位点相似（图1）。经2%琼脂糖凝胶电泳分析，RT-qPCR产物显示扩增片段大小为166 bp。将PCR 产物克隆到pMDTM18-T 载体后构建重组质粒PPRV dsDNA 标准品。质粒pMDTM18-N 标准拷贝数为1.22×1012copies/μL。

图1 PPRV N 基因引物靶序列的位置

2.2 RT-qPCR 标准曲线建立

将标准质粒pMDTM18-N 连续10 倍稀释构建标准曲线进行RT-qPCR。以质粒拷贝数的对数为横坐标，Ct 值为纵坐标，绘制标准曲线，建立的标准曲线相关系数R2为0.990，斜率为-2.33，截距为37.068（图2）。

图2 建立的RT-qPCR 标准曲线

2.3 cdPCR 反应条件确定及判定

图3-A 为芯片的扫描结果散点图，蓝色为阳性反应单元，黄色为阴性反应单元。由图可见，反应体系均匀涂布整个芯片，且封闭制作质量较好。散点图（图3-B）用两种颜色表示，分别显示了FAM 荧光基团扩增与未扩增的PCR 孔分布。选取FAM 和BHQ 两种荧光通道，可以在平面上显示两种荧光的分布强度，黄色对应于较低荧光的未扩增孔，而蓝色对应于明显较高荧光的扩增孔。未扩增孔和扩增孔之间的分布具有良好的区分性。统计柱形图（图3-C）显示了芯片阴性反应单元和阳性反应单元的分布，可以看出阴性和阳性反应单元之间形成独立的峰型。使用软件分析1.22×（105～102）copies/μL 4 个稀释度的标准品，结果见图3-D。每个稀释度作3 次重复，在每组中计算平均值的标准误差（SEM），以估计3 个试验的方差，每个样本代表试验独立性（P＜0.05）。

图3 cdPCR 反应条件建立

2.4 敏感性试验

将标准品pMDTM18-N 连续进行10 倍稀释（1.22×1012～1.22×102copies/μL）后进行PCR 检测，发现本试验设计的cdPCR 检测引物最低灵敏度为1.22×102copies/μL（图4-A）。比较OIE 推荐引物的灵敏度1.22×105copies/μL（图4-B），显示cdPCR引物敏感性高于OIE推荐引物1 000倍。cdPCR 在每个15.0 μL 反应体系中，最低灵敏度为（0.44±0.14）copies/μL。RT-qPCR 的检测 限 为1.22×10-1copies/μL，而cdPCR 为1.22×10-3copies/μL，说明cdPCR 比RT-qPCR 灵敏度高100 倍（表1）。

表1 cdPCR 和RT-qPCR 方法的敏感性试验比较结果

图4 不同引物的敏感性试验结果

2.5 特异性和重复性试验

特异性试验结果（表2、图5）显示，这两种方法均能特异性检测到PPRV，且与其他5 种病毒及阴性对照无交叉反应。对RT-qPCR 和cdPCR 检测的重复性进行评估，并结合定量结果变异系数（CV）来确定检测准确性。结果（表3）显示：cdPCR 的CV 范围为0.56%～10.73%，RT-qPCR 为3.11%～50.43%。这些结果表明，cdPCR 检测方法的重复性良好。

图5 RT-PCR 特异性试验结果

表2 cdPCR 和RT-qPCR 方法的特异性试验结果

表3 cdPCR 和 RT-qPCR 的重复性试验结果

2.6 临床样品检测

采用RT-qPCR 和cdPCR 方法对47 份临床样品的检测结果（表4）显示，cdPCR 的检出率为25.5%，高于RT-qPCR 的17.0%。但两种方法的检测结果均显示，血液样品的检出率较低，肺、肠和淋巴结样品的检出率较高。

表4 临床样品的检测结果 %

3 讨论

PPRV 属于OIE 规定的须通报动物疫病，我国法定的一类动物疫病。2013—2016 年我国许多地区暴发了PPR，严重威胁我国动物疫病防疫安全[6]。我国对PPR 采取相应的控制和扑灭措施，使疫情得到有效控制，目前只有零星地区散发疫情。PPRV对热、干燥和紫外线比较敏感，因此在自然环境中的存活时间较短，但是在雨季和冬季会容易流行。PPRV 在我国传播的形式以输入性传播为主，集中在引种方面。引种时一旦没有做好及时的隔离和处置，就会有疫情地方性流行的风险。显然，早期快速和精准诊断在PPR 的防治方面将发挥着重要作用。

PCR 方法具有快速、敏感性高、特异性强等优点，但它需要后续电泳等处理，易出现假阳性和交叉污染[7]。相比传统PCR，cdPCR 具有更高的敏感性和特异性，同时缩短了检测时间，无须核酸电泳，结果直接读取，方便基层没有实验技术背景的工作人员操作。近年来 RT-qPCR 的应用已经改善了PPRV 核酸扩增方法[8]。该方法的灵敏度相对比常规RT-PCR 高10～100 倍，并且降低了污染风险。尽管RT-qPCR 核酸扩增方法在病原检测领域快速发展，但同时也伴随着一系列问题。例如：基于CT和ΔCT值的样品和/或标准品之间的相互依赖关系，在RT-qPCR 中，试验理想情况下需要在同一PCR 反应板上运行每个靶标的所有样品，最大限度地减少操作失误[9]。事实上，对于分布在多个位置之间的同一样品，要获得重复性好的试验数据一直是RT-qPCR 的一项重大挑战。尽管RT-qPCR 已广泛用于核酸定量，但它需要将未知物与标准品进行比较以获得定量信息。RT-qPCR基于荧光探针在PCR 的每个循环后监控扩增的模拟检测量，当样品的目标检测率低且差异基因表达水平低时，该技术检测能力受到限制。而相比RTqPCR，cdPCR 则不需建立标准曲线，直接给出靶序列的拷贝数，更加适合低拷贝核酸样品的检测。

本研究成功建立了一种cdPCR 检测方法用于PPR 诊断，显示出比OIE 推荐引物具有更高的灵敏度。cdPCR 相比RT-qPCR 在PPRV 特异性检测方面无明显差别，而在灵敏性方面比RT-qPCR 提高100 倍，且无需构建标准品和标准曲线，在相对病原浓度较少的样品中可发挥更高的灵敏度优势，同时样品处理也减少了“动手”所需的时间，并且芯片的密封可最大程度地减少非特异扩增子和其他核酸的污染。综上所述，本研究建立的cdPCR 检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点，在实际生产中可为预防PPR 早期流行提供一种快速有效的诊断和定量方法。