一例猫慢性牙龈炎病例的病原学诊断

白艺兰，刘 健，鞠厚斌，常晓静，徐 锋，沈莉萍，龚国华，朱晓英，王晓旭，王 建，赵洪进

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

猫杯状病毒（feline calicivirus，FCV）属杯状病毒科、水疱疹病毒属，无囊膜，基因组为单股正链RNA，包含180 拷贝的VP1和1～10 拷贝的VP2基因。FCV 除引起猫呼吸道症状外，还可引起猫慢性牙龈炎（feline chronic gingivostomatitis，FCGS），严重危害猫的健康[1]。

FCGS 是一种发生于牙龈、口腔黏膜的慢性炎症，常由多种病原引起，使患病猫出现厌食、口腔分泌物增多等症状，引起动物极大痛苦[2]。2020年11 月，上海市某宠物医院接诊一例疑似猫FCV感染病例。该病例近半年以来，口腔一直产生大量唾液，并出现溃疡以及牙龈肿胀、出血、增生等症状，其间曾用抗生素治疗，开始有些效果，但几日后便会复发，后期鼻腔也开始出现分泌物。为了解病因，采集眼、口、鼻拭子进行病原分离鉴定，结果显示为FCV 继发大肠杆菌和多杀性巴氏杆菌感染。为了解FCV 的变异特点，对FCV 分离株进行了序列分析。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

DMEM 细胞培养液、胰酶消化液（0.25%），均购自GIBCO 公司；胎牛血清（FBS），购自SIGMA 公 司；PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）试剂，购自宝日医生物技术（北京）有限公司；哥伦比亚琼脂，购自美国BD 公司；脱纤维羊血，购自上海科玛嘉微生物技术有限公司。质谱仪配套材料：裂解试剂VITEK MS-FA、基质液VITEK MS-CHCA 等，均购自法国梅里埃公司；强力霉素、壮观霉素、林可霉素、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素等13 种药敏纸片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 采集发病猫的眼、口、鼻拭子并放入微生物采集管中。

1.2.2 细菌分离培养 将微生物采集管中的液体，接种于哥伦比亚羊血琼脂，置于37 ℃、5% CO2培养箱中，培养18 h，然后挑取可疑菌落纯化培养。

1.2.3 VITEK MS 质谱仪鉴定 从纯化平板上，挑取待测菌涂布在质谱条上的检测孔中，室温下干燥；加入0.5 μL VITEK MS-FA 裂解试剂，待干燥后再加入1.0 μL 基质液VITEK MS-CHCA；干燥后上机检测，取检测结果。

1.2.4 药敏试验 将细菌纯培养物，采用K-B 纸片法进行体外药敏试验，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，观察结果。试验方法及判读标准，参照杭州滨和微生物试剂有限公司提供的抗生素类药敏纸片说明书、纸片法药敏试验抑菌环直径判断标准。

1.2.5 FCV 分离培养 将含有棉拭子的微生物采集管置于-80 ℃冰箱中冻融，12 000 r/min 离心5 min并收集上清，用0.22 μm 滤器过滤，接种于长满单层的F81 细胞培养并每日观察细胞病变。若未出现细胞病变，则取细胞培养的上清连续盲传2～3 代直至出现细胞病变；若出现细胞病变则反复冻融3次，分装至冻存管，保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.2.6 FCVVP1基因扩增 采用滤膜提取核酸方法提取细胞培养物中的核酸，根据文献[3] 中的方法，使用One Step RT-PCR 试剂进 行RT-PCR 扩增。上游引物VP1-F 序列为ATGTGCTCAACCTGCGC，下游引物VP1-R 序列为TCATAATTTAGTCATTGAGC。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.7VP1序列分析与遗传进化分析 将分离株的VP1基因及氨基酸序列与GenBank 上载录的参考株序列（表1）进行遗传进化分析，并用MegAlign（MEGA）软件构建遗传进化树。

表1 国内外FCV 参考序列

2 结果

2.1 细菌分离鉴定

2.1.1 分离株培养特性 拭子涂板后，分离到2株不同的菌株：1 株于哥伦比亚羊血琼脂上呈现β溶血环、灰白色、圆形，菌落直径为1.0～1.5 mm（图1-A）；另1 株不溶血，呈灰色、圆形，菌落直径为0.5～1.0 mm（图1-B）。

图1 哥伦比亚血琼脂上分离菌菌落形态

2.1.2 分离株的MS 鉴定 通过VITEK MS 鉴定分析，在琼脂上呈现β 溶血环的分离株为大肠杆菌，另1 株不溶血的分离株为多杀性巴氏杆菌。

2.1.3 分离株药敏试验 分离的大肠杆菌和多杀性巴氏杆菌的药敏试验结果（表2）显示：大肠杆菌分离株对红霉素、林可霉素耐药，多杀性巴氏杆菌对阿米卡星、庆大霉素、壮观霉素、林可霉素耐药。

表2 分离株对抗菌药物的耐药情况

2.2 病毒分离培养

样本经滤器过滤后接种F81 细胞6 h、24 h 后观察到典型细胞病变（图2-A、B），细胞变圆皱缩，聚成葡萄串状，逐渐脱落。

图2 F81 细胞病毒分离培养结果（100×）

2.3 病毒RT-PCR 鉴定

收集细胞培养物提取核酸后使用特异性引物进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳后，约在2 000 bp 处出现特异性条带，大小与理论值相符（图3），将其命名为FCV20-2。

图3 FCV20-2 VP1 基因PCR 扩增结果

2.4 VP1 基因测序及序列分析

2.4.1 同源性分析 利用MEGA 软件将获得的FCV20-2 分离毒株VP1 核苷酸序列与表1 中的序列进行比对发现：分离株VP1序列与18 株序列的核苷酸同源性为74.2%～81.0%（图4），其中与美国2280（VSD 株）同源性最低，与中国GD 株同源性最高，与其他7 株中国株的核苷酸同源性为74.3%～78.1%；与国内FCV 疫苗株255 的核苷酸同源性较低，为75.9%，与F9、2024、F4 等其他国家疫苗株的同源性也较低，为75.1%～75.8%（图4）。氨基酸同源性分析结果（图5）显示：分离株与其他18 株同源性为82.2%～88.1%，其中与日本F9 株同源性最低，与中国GD 株同源性最高，与国内使用的疫苗株255 同源性为85.1%。上述结果表明，FCVVP1基因变异程度较大。

图4 FCV20-2 毒株与其他毒株VP1 基因核苷酸序列同源性分析结果

图5 FCV20-2 毒株与其他毒株VP1 蛋白氨基酸序列同源性分析结果

2.4.2 基因进化树分析 将FCV20-2 株VP1基因序列与其他毒株VP1基因进行比对构建系统进化树。结果（图6）显示：FCV 遗传关系较复杂，其中FCV20-2 株VP1序列与中国株HB-S4 同属于一个分支，与其共处同一大分支的5 株毒株均为中国株，但与另一分离自上海的中国株SH2014 遗传距离较远，并且该毒株与目前临床上使用的疫苗株255、F9、F4 等处于不同的进化分支，提示疫苗免疫可能存在失败风险。

图6 VP1 基因遗传进化树分析结果

2.4.3 D、E 区重要氨基酸位点分析 对VP1线性表位（402～524 aa）的分析结果（图7）显示：比对的19 株序列D 区较为保守，E 区变异较大，其中D 区线性表位（415～421aa）及conE 区（475～479aa）高度保守，而E 区线性表位5'HRV（445～457aa）高度变异；与抗体反应有关的第439～441 位氨基酸同样变异较大。

图7 VP1 蛋白D 区和E 区氨基酸比对结果

3 讨论

FCGS 是一种猫常见的慢性疾病，对猫可造成严重的疼痛和困扰，被认为是患病猫对一系列口腔病原产生的不当免疫反应[3]，因此治疗较为困难和有限。到目前为止，还没有有效消除该病所有症状的办法，但是将口腔卫生、拔牙和辅助医疗结合起来，可减轻大多数患病猫的病症[4]。本研究中病例的症状表现为典型的FCGS，患病猫出现口腔溃疡、口腔分泌物增多、牙龈肿胀等临床症状，且病情持续超过半年，其间使用过抗生素治疗，并进行拔牙术，仅有少许好转，病原分离鉴定为FCV 混合细菌感染。FCV 被确认为是引起猫上呼吸道感染和口腔溃疡性病变的重要病原体。研究[5]表明，FCV 感染与FCGS 严重程度呈正相关，FCV 在刺激宿主对FCGS 的免疫反应中可能很重要。

细菌同样是引起FCGS 的重要病原。研究[6]报道，多杀性巴氏杆菌是FCGS 病例中常见的病原菌。本病例中同样分离得到一株多杀性巴氏杆菌。对于FCV 感染较为严重的口腔和呼吸道疾病，一般建议采用广谱抗生素治疗，以尽量减少与继发性细菌感染相关的潜在并发症。但大量研究表明，不同国家及地区的分离菌已对临床常用药物产生了不同的耐药性，对治疗产生了不利影响[7]。为此，本研究进行了耐药性分析，根据病原菌及其对临床常用药物产生的耐药性特点，使用氧氟沙星、诺氟沙星对该病例进行针对性治疗。另外研究[8]表明，口服重组猫干扰素-ω（rFeIFN-ω）可成功治疗顽固性FCGS。

FCV 感染在猫科动物中广泛存在，除家猫外还有虎、狮等大型猫科动物[9]。该病毒易变异，病毒衣壳蛋白VP1 序列的变异尤为突出[10]。疫苗仍是预防FCV 感染的主要途径，但目前FCV 疫苗保护力下降时有报道[11]。一项对我国近年来猫接种FCV 疫苗后的血清学调查显示，抗体阳性率仅为58.3%[12]。本研究对分离的FCV20-2 株的VP1 序列进行了测序及分析，发现该毒株VP1与其他18株序列的核苷酸同源性为74.2%～81.0%，氨基酸同源性为82.2%～88.1%，变异程度较高。由于FCV VP1 E 区包含主要的B 细胞表位，因此该区域是病毒中和抗体的靶位点。对VP1 D 区和E 区分析发现，比对的19 株序列D 区较为保守，而E 区变异较大，且E 区线性表位5'HRV（445～457 aa）高度变异，与之前相关报道[13-15]相符。与抗体反应有关的第439～441 位氨基酸同样变异较大，并且构建进化树分析发现，其与目前临床上使用的疫苗株255、F9、F4 等处于不同的进化分支，提示当前的疫苗可能不能对FCV 感染提供较好的保护。该变异对VP1 蛋白抗原性的改变还需进一步验证。