豚鼠气单胞菌引起山羊猝死的鉴定

黄紫贝，管飘萍，郭 鑫，王海燕，焦库华，刘文博，4

（1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009；3.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300；4.扬州大学动物疾病检测与技术服务中心，江苏扬州 225009）

气单胞菌属早期曾归属于弧菌科，后来研究发现气单胞菌与弧菌的同源性不高，于是将气单胞菌属自弧菌科移出[1]，现已独立为气单胞菌科[2]。它包括3 个复合群，分别是维罗纳气单胞菌复合群、嗜水气单胞复合群和豚鼠气单胞复合群[3]。临床上的感染主要由豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞菌以及温和气单胞菌单独或混合引起，主要发生于水生动物，如：Zhu 等[4]研究报道了野生花鼓鱼的不断死亡是由维氏温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌和嗜水气单胞菌混合感染所致，陈翠珍等[5]研究报道了鲢鳙打印病是由豚鼠气单胞菌引起的，樊海平等[6]报道了欧洲鳗鲡败血症与豚鼠气单胞菌有关，徐海圣等[7]研究报道中华绒螯蟹的“抖抖病”也是由豚鼠气单胞菌引起的。

豚鼠气单胞菌是直杆状、兼性厌氧革兰氏阴性菌，对营养要求不高，广泛存在于淡水、污水及土壤[2]。近年来发现，豚鼠气单胞菌不仅可感染鱼类、两栖类等，还可感染哺乳类动物，至今已有狐狸[8]、熊猫[9]、羊驼[10]、林麋[11]等发病致死的报道。2020 年Giannattasio-Ferraz 等[12]从健康小母牛尿液中也分离到豚鼠气单胞菌。自2019 年以来，气单胞菌属中至少有19 种被认为对人类有危害，导致广谱感染[13]。目前，国内未见豚鼠气单胞菌引起山羊感染的报道。本研究首次从山羊的内脏及组织病料样品中分离得到豚鼠气单胞菌，并对其进行了药敏试验及致病性试验，以期为养殖和防疫人员做好该病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源及背景

2020 年5 月5 日，江苏省某养殖场送检2 只病死山羊。据了解，发病山羊10 d 前购进，已注射小反刍兽疫疫苗，但未进行羊痘和羊梭菌疫苗免疫。部分山羊出现咳嗽、拉稀、猝死，死亡率为11.36%（25/220），疑为产气荚膜梭菌感染。采集2 只病死山羊的肠道、肝脏、肾脏、脾脏、淋巴结等病变组织器官进行实验室检测。

1.2 细菌分离

取病死山羊的肝脏、肾脏、脾脏、肠系膜淋巴结以及十二指肠和盲肠内容物，分别无菌接种于产气荚膜梭菌培养基平板（购于青岛海博生物技术有限公司）进行厌氧培养，37 ℃过夜；挑取典型菌落进行纯化，纯化3 代后挑取单个菌落，在血平板上37 ℃培养，观察菌落特征，并进行革兰氏染色、镜检。

1.3 生化试验

利用生化编码鉴定管（购于杭州微生物试剂有限公司），对所分离的菌株进行生化指标测定。具体操作方法和判定标准参照鉴定管说明书。

1.4 16S rRNA 基因扩增和序列分析

利用煮沸裂解法提取细菌DNA 模板：用接种环挑取纯培养后的单菌落，置于装有200 μL 超纯水的灭菌管中，100 ℃热变性10 min，取2 μL上清作为模板进行PCR 扩增（TaKaRa16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit 试剂盒）。将纯化的DNA 经1%琼脂糖凝胶电泳验证后，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，并进行BLAST 以确定其分类。

1.5 药敏试验

取分离菌株采用纸片法进行药敏试验（药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司），具体操作方法和判定标准参照药敏纸片产品说明书。

1.6 致病性试验

挑取单个纯化菌落接种于LB 液体培养基，37 ℃ 150 r/min 培养18 h，细菌平板计数含量为1.76×1011CFU/mL。将小鼠分为4 组，每组3 只，其中1～3 组分别腹腔注射0.3 mL 梯度（5.28×1010、5.28×109、5.28×108CFU/mL）的细菌悬液，第4组小鼠注射等量无菌PBS 作为空白对照，每隔2 h观察和记录小鼠发病和死亡情况，持续1 周，分析菌株致病性。

2 结果

2.1 细菌分离镜检

厌氧培养24 h 后，大肠和小肠内容物在培养基上出现密集的黑色菌落（图1-A），其他脏器病料中未分离出细菌。该菌在血琼脂平板上37 ℃培养过夜后形成2 mm 大小，圆形、光滑、湿润、稍凸、灰白色或淡灰色菌落（图1-B）。挑选单菌落纯培养后镜检，发现分离菌为革兰氏阴性短杆菌，排列成单或成双，两端钝圆（图1-C）。

图1 分离菌株的菌落形态及革兰氏染色镜检结果

2.2 生化试验

将分离菌接种于细菌生化微量鉴定管培养过夜，结果发现分离菌生化特性符合豚鼠气单胞菌生化特性（表1）。

表1 分离菌生化试验结果

2.3 16S rRNA 基因扩增和序列分析

对分离菌株16SrRNA 基因进行BLAST 比对，并通过系统发育关系分析发现，该序列与豚鼠气单胞菌具有高度同源性，达99.92%（图2）。综合临床症状、镜检结果、生化反应结果以及16SrRNA基因序列测定与分析结果，确定该病原菌为豚鼠气单胞菌。

图2 基于16S rRNA 基因序列亲缘关系进化树

2.4 药敏试验

分别用21 种常用抗菌药物对分离菌株进行药敏试验，结果发现分离菌株仅对呋喃唑酮敏感，对多黏菌素B 和环丙沙星介于敏感与耐药之间，而对其余 18 种抗菌药物均耐药（表2）。

表2 分离菌药敏试验结果

2.5 致病性试验

第1 组小鼠2 h 后皆出现萎靡不振、四肢站立不稳、厌食等症状，24 h 内全部死亡，其他攻毒组在72 h 内全部死亡（表3）。剖检死亡小鼠发现，心脏、肺脏淤血（图3-A），十二指肠出血，肠壁水肿（图3-B）。对照组小鼠未出现明显临床症状（图3-C、D），1 周后试验结束，剖检亦未见明显病理变化。将病变组织无菌划线接种在血平板上分离培养，通过16SrDNA 测序和生化鉴定分析，确定与之前从猝死羊体内所分离的豚鼠气单胞菌生化特性和序列基本一致。

表3 细菌致病性试验分组情况

图3 SPF 小鼠攻毒1 周后剖检结果

3 讨论

近年来山羊养殖方式发生了改变，逐渐向集约化、规模化以及高床养殖发展，使山羊运动范围小、运动量小、微环境条件差。养殖方式的改变，导致山羊抵抗力下降，继而各种条件致病菌趁虚而入，造成感染发病，甚至山羊大规模死亡，对养殖业造成一定危害和损失。目前有关山羊继发细菌感染报道最多的是产气荚膜梭菌引起的梭菌病，而对其他菌造成的急性死亡认识很少，以至于出现急性死亡病例时就会认为是产气荚膜梭菌引起的，从而出现临床误诊。在分离本细菌时，虽然使用产气荚膜梭菌培养基，且培养出黑色的，类似于产气荚膜梭菌的菌落，但并不意味分离出的细菌就一定是产气荚膜梭菌，必须进一步鉴定。本研究团队临床上对羊猝死病例使用该培养基分离出不少其他梭菌（另文发表）。本研究在脏器中未分离出细菌，可能是由于该菌主要在肠道内增殖，毒素迅速出现，造成山羊突然死亡，未造成菌血症，也未通过血液进入脏器和淋巴结。

耐药试验结果显示，此豚鼠气单胞菌分离株具有广泛的耐药性，对18 种抗菌药物耐药，仅对呋喃唑酮敏感，因此在诊疗中需针对性地选用敏感的抗菌药物。Wu 等[14]研究了酵母糖蛋白（YG）对从鱼肝脏中分离得到的豚鼠气单胞菌抗菌活性，并描述了其可能的抗菌机制，旨在寻找传统抗菌药物的潜在替代品。本研究希望为养殖者在养殖过程中合理应用抗菌药物提供参考，以减少耐药菌株产生的可能性。

作为条件致病菌，豚鼠气单胞菌较容易感染有免疫功能缺陷的患者，可引起胃肠炎、血流感染、呼吸系统感染、泌尿系统感染、眼部感染、脑膜炎及肝脓肿等[15]。Kimura 等[16]评估了日本的菌血症发生情况，发现豚鼠气单胞菌是航空菌血症的常见病原体。2015 年李任文等[17]报道过一位男性因被青蟹咬伤致豚鼠气单胞菌感染休克死亡的案例。2018 年有文献报道了类似霍乱的气单胞菌感染病例[18]。Sharma 等[19]曾对禽类及牛羊等动物源食品进行气单胞菌分离鉴定及小鼠致病性试验，结果从鸡中分离到具肠毒性的豚鼠气单胞菌。气单胞菌菌种越来越与胃肠道感染有关，尽管在属之间以及内部的致病性和毒力上有明显差异[18]。小鼠致病性试验说明该菌具有一定的致病性，但其主要感染水生动物和两栖类动物，因而关于陆生动物感染致死的报告较少[20]。而且豚鼠气单胞菌作为一种典型的人-兽-鱼共患病原菌，其可能会感染更多患有潜在疾病的老年人及动物，因此人们要对该属有更广泛的认识，要深入了解潜在新物种、不同寻常的抵抗机制和具有不同病程疾病的混合感染引发的问题，加强对该菌的监测，切断其传播途径，减少该菌在不同宿主间的循环。