罗湖病毒RT-LAMP 方法的建立与应用

徐淑菲，林双庆，陈信忠，刘启霖，蔡绍鑫，曾韵颖，朱黄鑫，方成俊，孔凡德

（1.厦门海关技术中心，福建厦门 361026；2.东山海关综合技术服务中心，福建东山 363401；3.厦门海关，福建厦门 361000）

罗非鱼是全球第二大重要的养殖鱼类。我国为世界第一罗非鱼养殖大国，养殖产量约占世界总产量的50%，主要集中于广东、广西、海南和福建等地，以出口为主。2009 年夏天，以色列某养殖场罗非鱼突然大量死亡，同年，自然生长的野生罗非鱼也出现大量死亡。经证明，死亡鱼感染了罗湖病毒（tilapia lake virus，TiLV）。随后，厄瓜多尔、埃及、马来西亚、哥伦比亚、泰国、印度以及中国台湾等相继发现TiLV 感染病例[1-6]。2017 年雷燕等[7]研究报告称，从海南省养殖的罗非鱼中检测出TiLV。2019 年雷燕等[8]再次研究称，从广东、海南、福建等省的罗非鱼样品中均检出TiLV。然而，官方和其他研究团队目前均未有我国检出TiLV 的报道。

LAMP 技术即环介导的等温扩增技术（loopmediated isothermal amplification，LAMP），由于不需要PCR 仪和昂贵的试剂，目前已被广泛应用于肿瘤筛选、植物病毒检测、转基因食品检测、动物胚胎性别鉴定、水生陆生动物的细菌性及病毒性疫病检测等方面[9-10]。与普通PCR、荧光定量PCR相比，LAMP 优点突出，具有效率高、特异性好、肉眼可观察结果等特点。

目前，世界动物卫生组织（OIE）和我国尚未将TiLV 列入检疫名录，也无相应检测标准。因此，建立TiLV 检测方法，对于了解国内TiLV 的流行病学，建立对应的检测标准具有重要意义。TiLV为分段、单链的负链RNA 病毒，由10 个基因片段组成。本研究根据编码RNA 聚合酶的片段1，设计LAMP 引物，采用Genie II 等温扩增荧光检测系统，应用等温扩增技术原理，结合荧光检测技术，建立了检测TiLV 的RT-LAMP 方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集和处理 罗非鱼临床样品，一部分从福建省养殖场采集，具体包括诏安县梅川双田水库养殖场、漳州市常山基祥水产养殖场、诏安县红坑水库养殖场、福建铭兴食品冷冻有限公司四都水库养殖场、三姑娘水库养殖场、岭下溪水库养殖场、石厝底水库养殖场、梅州水库养殖场。另一部分为厦门海关每年进行TiLV 监控采集的样品。采集罗非鱼成鱼的肝、脾、肾和脑组织，-80 ℃冻存备用。

1.1.2 主要病毒核酸及浓度 真鲷虹彩病毒（red sea bream iridovirus，RSIV）、锦鲤疱疹病毒（koi herpesvirus，KHV）、流行性造血器官坏死病病毒（epizootic haematopoietic necrosis virus，EHNV）、金鱼造血器官坏死病病毒（goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV）、流 行性溃疡综合征（epizootic ulcerative syndrome，EUS）病原、鲤春病毒血症病毒（spring viremia of carp virus，SVCV）、传染性造血器官坏死病病 毒（infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV）、传染性鲑鱼贫血病病毒（infectious salmonid alphavirus，ISAV）、鲑鱼甲病毒（salmonid alphavirus，SAV）、病毒性出血性败血症病毒（viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV）等病原核酸，由深圳海关技术中心提供，上述病毒核酸浓度依次为20、20、20、30、22、20、23、15、20、20 μg/mL。

1.1.3 主要试剂及仪器 MagSi Total RNA Kit（货号M7930-02），为OMEGA 公司产品；2×Master Mix（IMM 产品号ISO-001），由北京晟泰勃科技有限公司提供；Evo M-MLV 反转录试剂盒（产品号AG11705），由艾科瑞生物有限公司提供。磁珠纯化系统（型号Auto-Pure32A），为杭州奥盛公司产品；台式冷冻离心机（型号Allegra64R），为Beckman 公司产品；等温扩增核酸检测系统（型号Genie Ⅱ），为OptiGene 公司产品。

1.1.4 TiLV 标准质粒和慢病毒 合成的TiLV 标准质粒和慢病毒序列相同，均为976 bp，包含本试验RT-LAMP 方法扩增的TiLV 片段序列（269 bp）。TiLV 质粒（5 ng/μL），由厦门普诺普和生物技术有限公司合成；TiLV 慢病毒（25 ng/μL），由厦门安提海拉生物科技有限公司合成，用以模拟真病毒。

1.1.5 相关引物 根据TiLV 毒株EC-2012 片段1（Genbank 登录号：MK392372），运用LAMP 引物设计软件PrimerExplorer，设计检测TiLV 的RTLAMP 引物，并送厦门普诺普和生物技术有限公司合成。

表1 引物序列

1.1.6 反应体系和反应条件（1）反转录10.00 μL 反应体系：gDNA Clean Reagent 1.00 μL，5×gDNA Clean Buffer 2.00 μL，Total RNA 7.00 μL。（2）LAMP 20.00 μL 反应体系：2×Master Mix 10.00 μL，TiLV-FIP/BIP（20 μmol/L）各1.25 μL，TiLV-F3/B3（10 μmol/L）各0.25 μL，TiLV-LoopF/B（5 μmol/L）各0.25 μL，模板1.00 μL，补充RNase-free water至总体积20.00 μL。若无特殊说明，均按照此反应体系进行试验。（3）反应条件：反转录试验为42 ℃，20 min；Genie II 等温扩增荧光检测系统默认的LAMP 反应条件（扩增65 ℃，30 min；退火从98 ℃到80 ℃，0.05 ℃/s），若无特殊说明，均按照此反应条件进行试验。

1.2 RNA 提取

按照MagSi Total RNA Kit 操作说明书进行RNA 提取。

1.3 RT-LAMP 方法建立及优化

取8 个荧光PCR 管，每管均加入2×Master Mix 10.00 μL、TiLV-LoopF/R 各0.25 μL、质量浓度为5.0×10-2ng/μL 的TiLV 质 粒1.00 μL 以 及TiLV-F3/B3 各0.25 μL（对应终浓度为0.25 μmol/L），然后第1～8 管依次加入TiLV-FIP/BIP 各1.75 μL（对应终浓度为1.75 μmol/L）、1.50 μL（对应终浓度为1.50 μmol/L）、1.25 μL（对应终浓度为1.25 μmol/L）；1.00 μL（对应终浓度为1.00 μmol/L）；0.75 μL（对应终浓度为0.75 μmol/L）、0.50 μL（对应终浓度为0.50 μmol/L）、0.25 μL（对应终浓度为0.25 μmol/L）、1.25×10-1μL（对应终浓度为1.25×10-1μmol/L），最后将每管反应体系用RNase-free water 补足至总体积20.00 μL。

1.4 RT-LAMP 方法灵敏度检测

将原始质量浓 度 为5.0 ng/μL 的TiLV 质 粒10 倍梯度稀释为5.0×10-1～5.0×10-8ng/μL。按照1.1.6 的RT-LAMP 反应体系（20.00 μL）配制试剂，分装到8 个荧光PCR 反应管中。第1～8 管分别加入经过梯度稀释的5.0×10-1～5.0×10-8ng/μL TiLV质粒各1.00 μL。按照1.1.6 的反应条件进行扩增。

1.5 RT-LAMP 方法重复性检测和熔解试验

将原始质量浓度为5.0 ng/μL 的TiLV 质粒10倍梯度稀释为5.0×10-1～5.0×10-8ng/μL。第1 组，按照1.1.6 的RT-LAMP 反应体系配制试剂，分装到8 个荧光PCR 反应管中，第1～8 管分别加入经过梯度稀释的5.0×10-1～5.0×10-8ng/μL TiLV 质粒各1.00 μL（对应终质量浓度为2.5×10-2～2.5×10-9ng/μL）。第2组为重复试验。按照1.1.6 的反应条件进行扩增和熔解试验。

1.6 RT-LAMP 方法特异性检测

按照1.1.6 反转录程序进行反转录试验，再按照1.1.6 的LAMP 反应体系配制试剂，平均分装到13 个荧光PCR 反应管中，第1～13 管分别加入初始质量浓度为5.0×10-2ng/μL 的TiLV 质粒、TiLV慢病毒、RSIV、KHV、EHNV、GFHNV、EUS 病原、SVCV、IHNV、ISA、SAV、VHSV、RNasefree water 各1.00 μL。按照1.1.6 的反应条件进行扩增反应。

1.7 临床样品检测

用建立的TiLV RT-LAMP 方法对300 份罗非鱼样品开展检测，反应体系和条件按照1.1.6 进行。

2 结果与分析

2.1 RT-LAMP 方法建立及优化

检测TiLV 的RT-LAMP 试验优化结果见图1。1～8 管反应结果对应图1 的曲线1～8，TiLVFIP/BIP 与TiLV-F3/B3 终浓度比例分别为14:1、12:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1。随着引物TiLV-FIP/BIP 与TiLV-F3/B3 终浓度比例的减小，即TiLV-FIP/BIP 浓度的减少，扩增曲线所需时间逐渐变长（即Ct 值逐渐变大），曲线4～7 甚至在30 min 内扩增不出目的产物。曲线1～3 均出现典型的“S”型扩增曲线，曲线4～8 均未出现扩增曲线；曲线1～3 Ct 值比较接近，根据节约试剂材料原则，选择3 号曲线即第3 管的引物浓度和比例。

图1 RT-LAMP 引物最佳浓度探究结果

2.2 RT-LAMP 灵敏度检测

RT-LAMP 灵敏度检测结果如图2。第1～8 管分别对应图2 中的曲线1～8。曲线1～8，模板浓度逐渐递减，Ct 值越来越大，总反应时间为30 min。本试验可检测到第6 管，对应的是图2 中曲线6，终质量浓度为2.5×10-7ng/μL。因此，检测TiLV 的RT-LAMP 方法的灵敏度为2.5×10-7ng/μL。

图2 RT-LAMP 灵敏度检测结果

2.3 RT-LAMP 重复性检测和熔解曲线

RT-LAMP 方法的重复性和熔解曲线试验结果如图3。第1 组试验是图3 中实线所示扩增曲线，第2 组是虚线所示扩增曲线。实线/虚线1～8 分别对应第1/2 组的第1～8 管。由图片可见，两组试验的重复性较好；两组试验熔解曲线均在84.5～85.0 ℃之间，略有差异，属于试验误差，最大误差是0.5 ℃，误差率0.6%，不影响整体熔解曲线的一致性，重复性较好，可判定扩增的是同一产物。

图3 RT-LAMP 重复性和熔解曲线检测结果

2.4 特异性试验

特异性分析试验结果见图4。图4 显示，建立的检测TiLV 的RT-LAMP 方法仅能够对TiLV 质粒及慢病毒进行特异性扩增，扩增曲线呈现典型的“S”型，而对RSIV 等其他病毒均无扩增曲线，说明该方法特异性良好。

图4 RT-LAMP 特异性检测结果

2.5 临床样品检测

对300 份罗非鱼样品应用本试验建立的RTLAMP 方法进行检测，结果均未检出TiLV。综合相关文献报道[1-8]及每年海关、水产技术推广站的监测结果，推测目前国内罗非鱼感染TiLV 的可能性极低。

3 讨论

Del-Pozo 等[11]研究发现，TiLV 具有正黏病毒超微结构特征，因此推测TiLV 可能是一种新的正粘病毒。TiLV 基因组共有10 个片段，最大的是基因片段1。此片段有一个开放阅读框，与丙型流感病毒PB1 亚基序列同源性较低[12]。但LAMP 设计引物比较难，设计双重引物更难，双重LAMP 的建立相比双重PCR 和双重qPCR 更难。本团队后续还会尝试建立检测TiLV 和病毒性神经坏死病病毒（VNNV）的双重RT-LAMP。

LAMP 是2000 年由日本研究人员Notomi[13]等发明的一种新型体外等温扩增特异核酸片段的技术。其特点是针对靶基因的6 个区域设计4种特异引物，在链置换DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，60～65 ℃恒温扩增，15～60 min即可实现109～1010倍的核酸扩增。与普通PCR、荧光定量PCR 相比，LAMP 的优点突出：LAMP 不需要昂贵的精密仪器，恒温状态即可；LAMP 扩增效率高，能够获得大量扩增产物，具有高特异性；通过添加loop 引物，可以加快反应，缩短一半时间（常规LAMP 反应大约需要1.0 h，加入loop 引物后可缩短为0.5 h）；扩增可产生大量的副产物焦磷酸镁白色沉淀，肉眼即可观察结果，也可借助于斑点杂交或横向流动试纸条等方法辅助结果检测。本研究建立的RT-LAMP 方法，采用Genie II等温扩增荧光检测系统，可以实时监控扩增反应，通过扩增曲线进行结果判定，克服了传统靠肉眼观察结果的盲目性。但LAMP 方法也有其缺点，就是更容易污染，因此在试验过程中要特别谨慎小心。

等温扩增荧光检测系统已在疫病检测中得到应用。史秀杰等[14]、何俊强等[15]在Genie II 实时荧光等温扩增检测系统的基础上，建立了检测ISA、IHNV 的LAMP 方法。安元龙等[16]运用Genie II 实时荧光等温扩增检测系统，建立了对VHSV 进行荧光实时反转录环介导等温扩增检测方法。侯东君等[17]选定了一套可在牛羊肉中特异并灵敏检测出掺杂肉成分的引物对，以动物细胞色素b 基因组为模板可在恒温63 ℃特异性扩增出猪等基因片段而无其他扩增片段影响。徐淑菲等[18-20]建立了检测牛、猪、羊、鸡、鸭等动物源性成分的LAMP 方法。等温扩增荧光检测系统，结合荧光检测技术，比传统LAMP 方法更为完善，克服了感官判定的不确定因素，使结果更加准确可信，且可以实时监控。

本研究建立的检测TiLV 的RT-LAMP 方法，检测灵敏度是2.5×10-7ng/μL，灵敏度较高。其原因在于LAMP 方法有6 条引物，而且FIP 由F2 区和F1C 区域组成、BIP 由B1C 和B2 区域组成，且碱基长度远远超过普通PCR 引物。但LAMP 试验极易受气溶胶等污染，因此操作过程要非常小心。本研究成功建立了检测TiLV 的RT-LAMP 方法，为快速诊断、监测TiLV 提供了技术支撑。