皮肤鳞状细胞癌中SDF-1/CXCR4的表达及意义

李珍玲，那佈其，王雪妍，崔银姬，金雪梅，权春姬

皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC)是起源于表皮或附属器角质形成细胞的一种恶性肿瘤，是非黑素瘤皮肤肿瘤致死的首要原因。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1, SDF-1)又称CXCL12，是由骨髓基质细胞产生的CXC类趋化因子，而CXCR4为其主要受体。近年研究证实，SDF-1和CXCR4广泛、特异地表达于多种细胞与组织中，尤其是在多种肿瘤的发生、增殖、分化和器官特异性转移中发挥重要作用[1-3]。尽管SDF-1/CXCR4在多种肿瘤中高表达，但其在CSCC组织中表达的研究较少。本实验采用免疫组化EnVision法检测SDF-1、CXCR4蛋白在CSCC、鲍温病(Bowen’s disease, BD)和癌旁正常皮肤组织中的表达，进一步探讨其在CSCC发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料选择2011年1月～2018年3月吉林省延边大学附属医院存档的手术切除的100例CSCC、32例BD、15例癌旁正常皮肤组织，另选取CSCC组织芯片(购自上海芯超生物公司)58点作为实验样本。158例CSCC中，男性83例，女性75例，年龄35～96岁，平均(72.03±13.53)岁。32例BD中，男性15例，女性17例，年龄52～85岁，平均(70.83±9.12)岁。所有患者术前均未行放、化疗。

1.2 主要试剂兔抗人SDF-1、CXCR4多克隆抗体购自北京博奥森生物公司和武汉伊莱瑞特生物公司，HRP标记山羊抗小鼠/兔二抗、PV 6000试剂盒、DAB显色剂购自北京中杉金桥生物公司。

1.3 免疫组化采用免疫组化EnVision法染色。染色步骤：3 μm厚常规切片，脱蜡至水，EDTA 9.0高压抗原热修复，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，10%正常山羊血清封闭后，滴加一抗SDF-1(稀释比1 ∶100)、CXCR4(稀释比1 ∶60)4 ℃过夜；次日PBS洗涤后加入二抗，37 ℃孵育50 min，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封固，镜下观察。以乳腺癌组织作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断SDF-1、CXCR4表达定位于细胞膜/胞质，随机观察10个高倍视野，每个视野计数100个细胞，根据其中阳性细胞所占百分比和染色强度分别进行评分。(1)按阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞数<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分；(2)按染色强度评分：未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两项评分结果相乘：0～1分为阴性(-)，2～3分为(+)，4～5分为()，6分以上为()。将(～)视为强阳性。

1.5 统计学分析采用SPSS 24.0软件进行统计学分析，计数资料以频数表示，采用χ2检验或Fisher确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同皮肤组织中SDF-1、CXCR4蛋白表达染色特点SDF-1、CXCR4阳性均定位于细胞质，阳性细胞呈棕黄色颗粒状。在正常皮肤组织中SDF-1阳性细胞少量分布于基底层细胞且呈弱阳性(图1A)，在BD中阳性细胞主要分布于表皮全层异型细胞(图1B)。在高分化CSCC中SDF-1弱表达于角化珠周边近基底部的肿瘤细胞(图1C)，中～低分化CSCC中强表达于所有肿瘤细胞(图1D)。CXCR4在正常皮肤及BD全层表皮中表达(图2A、B)，并且在毛囊、皮脂腺部位也有表达，强弱不等。在高分化CSCC中主要表达于角化珠周边棘层(图2C)，中～低分化CSCC中弥漫表达于几乎所有的肿瘤细胞，强弱不等(图2D)。

图1 SDF-1在不同皮肤组织中的表达：A.癌旁正常皮肤组织；B.鲍温病；C.高分化皮肤鳞状细胞癌；D.中～低分化皮肤鳞状细胞癌，EnVision法 图2 CXCR4在不同皮肤组织中表达：A.癌旁正常皮肤组织；B.鲍温病；C.高分化皮肤鳞状细胞癌；D.中～低分化皮肤鳞状细胞癌，EnVision法

2.2 不同皮肤组织中SDF-1、CXCR4的表达SDF-1在癌旁正常皮肤、BD和CSCC组织中的阳性率呈上升趋势，其阳性率分别为33.33%、68.75%、87.97%、差异有统计学意义(P<0.001，P<0.05，表1)。CXCR4在癌旁正常皮肤、BD、CSCC组织中的阳性率分别为73.33%、75.00%、86.08%，差异无统计学意义(P>0.05，表2)。在CSCC中SDF-1和CXCR4强阳性率分别为44.93%和40.51%，显著高于BD中的强阳性率，差异有统计学意义(P<0.05，表3)。

表1 不同皮肤组织中SDF-1的表达

表2 不同皮肤组织中CXCR4的表达

表3 鲍温病和皮肤鳞状细胞癌中SDF-1和CXCR4的强阳性率

2.3 CSCC中SDF-1、CXCR4表达与临床病理特征之间的关系分析SDF-1、CXCR4蛋白表达与CSCC临床病理特征之间的相关性，结果显示SDF-1高表达与CSCC分化程度和侵袭程度相关(P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤大小、皮损部位、有无神经脉管浸润无关(P均>0.05)。CXCR4高表达与肿瘤侵袭程度相关(P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤大小、皮损部位、分化程度、是否神经脉管浸润无关(P>0.05，表4)。

表4 SDF-1和CXCR4蛋白表达与皮肤鳞状细胞癌临床病理特征的关系[n(%)]

3 讨论

CSCC是仅次于基底细胞癌的第二常见的皮肤恶性肿瘤，好发于老年人，具有较强的恶性趋势，主要发生于曝光部位的皮肤，尤其是面、颈、手背。BD又称为原位鳞状细胞癌，进展缓慢，3%～5%病变演变成侵袭性鳞状细胞癌[4]。CSCC的发生、发展涉及多基因和多种分子水平共同作用，是一个极其复杂的过程。趋化因子家族是肿瘤微环境的重要组成部分，其是多肽细胞因子的超家族，具有激活、趋化白细胞作用，许多疾病的发生均需要趋化因子的参与[5]。SDF-1称为基质细胞衍生因子，属于趋化因子CXC亚家族，主要由骨髓基质分泌，具有趋化作用。CXCR4是SDF-1的特异性受体，两者具有高度亲和力，两者结合后激活多条下游信号通路，在免疫反应、炎症、器官发育、血管生成、恶性肿瘤的浸润转移等方面发挥重要作用[6]。

研究表明，肿瘤组织高表达SDF-1可以提高肿瘤细胞的运动能力，甚至促进其上皮-间质转化，促进其向周围组织浸润[7-8]，而高表达CXCR4的肿瘤细胞迁移能力增强，并具有直接调控作用。多个研究已发现SDF-1/CXCR4生物学轴与肿瘤的关系密切，并已证明与患者的不良预后相关[9-10]，但在CSCC中的报道少见。Gong等[11]研究发现SDF-1在CSCC中表达增高，随着SDF-1的浓度增加A-431细胞的迁移能力增强，而这种迁移能力被AMD3100所抑制。本组前期实验结果显示，在CSCC中SDF-1 mRNA表达水平显著高于正常表皮[12]，同样本实验结果显示，SDF-1蛋白在BD和CSCC组织中表达上调，进一步发现SDF-1蛋白的高表达与肿瘤分化程度呈负相关，与肿瘤的侵袭程度呈正相关，提示SDF-1高表达与CSCC的发生、发展相关。CXCR4作为SDF-1的特异性受体，在不同类型的癌症中广泛存在，一项非小细胞肺癌的荟萃分析显示，转移性非小细胞肺癌中CXCR4的表达量明显高于非转移性非小细胞肺癌[13]，动物实验表明，高表达CXCR4的肿瘤细胞，在SDF-1趋化、牵引下转移至SDF-1表达较高的某些器官，形成器官特异性转移。临床研究显示，CXCR4高表达与肿瘤淋巴结转移，复发、患者的低生存期密切相关[14-15]。本实验结果显示，CXCR4在CSCC中表达模式与其他肿瘤略有不同。首先，CXCR4蛋白在癌旁正常皮肤组织、BD、CSCC中表达无差异，在正常皮肤组织中的表皮、毛囊、皮脂腺中均有表达，这与Ciurea等[16]报道的CXCR4在正常皮肤中表达模式较一致。虽然CXCR4在三种不同皮肤组织中的表达差异无明显性，但在表达强度层面上分析发现CSCC中表达更强于BD，并与肿瘤侵袭深度相关，从而提示CXCR4在CSCC的进展中具有重要作用。

综上所述，本实验发现SDF-1和CXCR4在CSCC中表达上调，两者可能共同作用促进CSCC的发生、发展。大量的体内外实验已证明，抑制SDF-1/CXCR4的功能对控制恶性肿瘤的转移有显著效果，随着CXCR4抑制剂的发现，有望将SDF-1/CXCR4为分子靶点使CSCC的治疗取得新突破。