采用分子模拟方法探究巨噬细胞移动抑制因子与异噁唑类抑制剂的结合模式及相互作用

李焕婷 ，许磊 ，杨敏，高博闻

（1.包头医学院药学院，内蒙古包头 014040；2.江苏理工学院生物信息与医药工程研究所，江苏常州 213001）

巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一种具有促炎作用及免疫抑制作用的细胞因子，由巨噬细胞和T 淋巴细胞分泌，参与多种炎症和自身免疫疾病，如类风湿性关节炎、红斑狼疮、肾小球肾炎、糖尿病、动脉粥样硬化、败血症、哮喘、急性呼吸窘迫综合征等。此外，有研究结果表明MIF 在肿瘤的产生与发展中具有重要作用，包括调控细胞的增殖和促进血管的生成[1]。在皮肤、大脑、乳房、结肠、前列腺和肺的肿瘤组织中都发现了MIF 的过度表达，提示其与肿瘤的增长和转移密切相关[2]。因此，MIF 被认为是一个重要的药物设计靶点。MIF 具有多种酶的活性，包括D-多巴色素互变异构酶（DDT）、苯丙酮酸互变异构酶和巯基蛋白氧化还原酶[3-5]。MIF 是一种同源三聚体，催化活性位点位于同源三聚体的两个相邻单体之间［6］。N-末端脯氨酸（Pro1）具有不同寻常的pKa 值（5.60±0.10）[7]，是酶活性的关键残基。通过Pro1 共价修饰或丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸的定点突变可以完全消除MIF的互变异构酶活性[8]。

目前，针对MIF 的治疗策略包括基于抗体的抗细胞因子和小分子抑制剂治疗[9]，前者虽然可以有效抑制MIF 的生物活性，但是由于高风险、高投入及注射不方便等限制了其广泛应用；靶向MIF 的小分子抑制剂已经被大量报道，如多巴色素衍生物、对乙酰氨基酚衍生物、苯丙酮酸衍生物、希夫碱类、炔类化合物以及异噁唑类似物等[10]。1997 年，Ⅹue[11]等合成了一系列异噁唑类化合物，其中（S，R）-3-（4-羟基苯基）-4，5-二氢-5-异噻唑乙酸甲酯（ISO-1）作为MIF 的典型抑制剂被广泛研究。Lubetsky 等［12］修饰ISO-1 骨架结构中的苯环和乙酸侧链，并测试了这些衍生物对MIFD-多巴色素互变异构酶的抑制活性，发现没有包含p-羟苯基的衍生物其活性显著下降，而4-甲氧基类似物完全没有活性，进一步证实p-羟苯基在MIF 互变异构酶抑制的重要性；接着，Lubetsky 等进行了ISO-1 的生物活性研究，证明在成纤维细胞中ISO-1 可以抑制花生四烯酸的释放。此外，ISO-1 还强烈拮抗MIF 依赖的抗炎药物地塞米松的抑制作用。Al-Abed 等[13]进一步研究了ISO-1对MIF抑制的治疗潜力，证实ISO-1可以抑制MIF 的促炎活性，免受脓毒症和感染性休克的影响；通过细胞培养证实ISO-1 可以抑制MIF的互变异构酶活性和内毒素引起的TNF 的释放。Yousef 等［14］通过改变ISO-1 的烷基链获得了不同的脂肪、芳香酯类和酰胺类化合物（表1），实验证明脂类取代的衍生物相比酰胺类物质具有更强的抑制活性。

表1 ISO-1系列类似物的化学结构及MIF互变异构酶活性[14]Table 1 Chemical structure and MIF tautomerase activity of ISO-1 series analogs[14]

为了设计出抗炎活性更强的ISO-1 抑制剂分子，需要从原子水平深入探究MIF 重要氨基酸残基与ISO-1 类似物不同取代基对抑制剂结合的影响。因此，本文基于已知的MIF 与ISO-1（PDB ID：1LJT）及其类似物ISO-66（PDB ID：4K9G）的晶体结构，定量分析了受体-配体的结合模式及结构决定性因素，接着采用半柔性的Glide分子对接方法中3种不同精度的打分函数，将已知的ISO-1 系列抑制剂分别对接到MIF 结合口袋中，构建了MIF 与ISO-1类似物的复合物结构；通过比较3 种不同精度对接打分与实验活性的线性相关性，获得了最优的晶体结构和打分模式，进而以此晶体结构和打分模式对MIF 与ISO-1 系列典型类似物的结合模式进行分析，在此基础上设计了6 个新颖的ISO-1 类似物分子，分子对接打分及成药性预测显示，这些化合物可能具有较强的抗炎活性和较好的成药性。本文结果为深入了解MIF 特殊生物学功能的分子基础以及治疗MIF 相关疾病药物的开发提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 蛋白、配体准备

MIF 与ISO-1 及其类似物ISO-66 的晶体结构1LJT、4K9G 来自蛋白质数据库（http：//www.rcsb.org），采用Schrödinger 软件包中的蛋白准备模块Protein PreparationWizard 对MIF 的晶体结构进行预处理，包括修正键级，添加氢原子及部分电荷。根据实验和理论预测结果[17]，MIF 氮末端Pro1 保持质子化，只保留位于A 链和B 链的配体，删除其余2 个配体分子，删除所有的结晶水分子，将整个体系基于OPLS-2005 力场进行优化，当RMSD 值达到0.03 nm时优化终止。采用Schrödinger中的LigPrep模块在pH=7.4 条件下产生化合物的可能离子化状态和互变异构体。

1.2 分子对接

在采用分子对接方法进行虚拟筛选之前，首先需要验证所采用的Glide 对接方法的有效性，定义MIF 活性位点为以晶体结构中配体分子为质心的1 nm×1 nm×1 nm正方体区域，将MIF中所有部分电荷等于或者小于0.25 的原子范德华半径比例因子设为0.4，采用软对接方法处理MIF 的柔性，在第一步分子对接过程中每个配体最多产生5 000 个构象，只将其中打分最好的1 000 个构象进行能量最小化，在能量优化的过程中将配体分子的介电常数设为4，并且进行1 000步的共轭梯度法优化。

1.3 成药性预测

已知口服药物分子一般具有类似的理化性质，如分子量、脂水分配系数、水溶解度和氢键供体、受体数目等。本文采用Qikprop 软件对阳性对照化合物ISO-1 及设计的6 个新颖类似物进行了成药性预测。Qikprop 是一款快速、准确、简单易用的成药性预测软件，可以预测有机小分子与成药性密切相关的一些物理化学描述符，它通过与95%已知药物分子比较，给出了每种理化性质的合理范围区间。

2 结果与分析

2.1 MIF与ISO-1、ISO-66的结合模式分析

MIF 是同源三聚体（序列：UniProtKB P14174），相邻2条链之间可以结合配体分子，在4K9G晶体结构中，A链与B链之间的配体分子存在2种构象，配体显示为A，为了方便比较，只保留1LJT、4K9G 2个晶体结构中的B链、C链之间的配体分子。本文详细比较了MIF-ISO-1（PDB ID：1LJT）、MIF-ISO-66（PDB ID：4K9G）晶体结构中受体-配体结合模式。1LJT中ISO-1 配体结合位点口袋大小为44.374 9 nm3，而4K9G 中ISO-66 配体结合口袋大小为46.449 3 nm3，可见后者的结合口袋略大一点。

尽管两者的结合口袋大小略有差异，ISO-1、ISO-66 与MIF 结合模式具有较高的相似性，都位于由多个非极性氨基酸残基组成的疏水口袋，包括：Pro1、Met2、Ile64、Val106、Phe113 和Tyr209，其 中ISO-1、ISO-66 的芳香环都可以与Tyr95 的芳香环形成T-型的π-π 相互作用，与Lys32、Ile64 形成氢键相互作用（图1A、B）。ISO-1 异噁唑环上的氧原子和氮原子与Lys32 侧链上面的伯胺氮原子、Ile64 骨架上的酰胺氮原子间距离均为0.327 nm；ISO-1 酚羟基上面的氧原子与Asn97酰胺基上面的氧原子和氮原子距离分别为0.256、0.259 nm。ISO-66叔胺上的氮原子与Lys32 侧链上面伯胺氮原子距离为0.365 nm，与Ile64 骨架上的酰胺氮原子间距离为0.300 nm；ISO-66羟基上面的氧原子与Lys32侧链上面伯胺氮原子距离为0.280 nm；ISO-66 酚羟基上面的氧原子与Asn97酰胺基上面的氧原子和氮原子距离分别为0.266 nm和0.335 nm。

2.2 Glide 分子对接分析MIF 与ISO-1 类似物的复合物结构

为了验证Glide 分子对接的有效性，首先将1LJT、4K9G 2 种晶体结构中的配体取出，然后重新对接到MIF 结合口袋，通过图1C、D 对比发现Glide对接方法可以较好地重现配体的结合构象。根据原始晶体结构中配体构象与对接后配体构象的均方根偏差值（RMSD）大小，定量评价Glide对接方法对2 种配体的叠合情况。在1LJT 晶体结构中，只考虑配体重原子的RMSD=0.055 nm，而在4K9G 晶体结构只考虑配体重原子的RMSD=0.099 nm，可能由于ISO-1 具有异噁唑环，而ISO-66 具有更长的脂肪链，所以后者具有更大的旋转自由度。

图1 MIF与ISO-1（A）、ISO-66（B）的2D相互作用示意图；1LJT（C）、4K9G（D）晶体结构与Glide对接结构中配体构象叠合图Figure 1 2D representation of the interactions between MIF and ISO-1 (A),ISO-66 (B);the superposition of the Glide docked inhibitor and its original structure in the crystallographic complex(C:1LJT;D:4K9G)

晶体结构虽然可以提供受体-配体较为详细的结合模式，但只能显示单一的静态构象，同一个蛋白靶点如果针对不同的晶体结构、不同对接精度打分函数进行虚拟筛选，结果会有较大差异。在目前广泛采用的半柔性分子对接过程中，受体的结构不发生变化，对接口袋大小主要基于配体的结构柔性变化。由于配体分子具有较大的化学差异性，因此具有不同配体的晶体结构对打分结果也会具有较大影响。本文基于已知的MIF-ISO-1、MIF-ISO-66的晶体结构，采用Glide 中3 种不同精度（HTVS、SP、ⅩP）的对接打分方法，分别构建了MIF 与ISO-1类似物的复合物结构，接着比较了3 种精度打分方法得到的对接打分与实验活性的线性相关性（图2）。

虽然按照Glide 分子对接打分模式的计算精度，HTVS＜SP＜ⅩP，但从图2 可见，无论针对1LJT 还是4K9G 的晶体结构，HTVS 结果都要优于SP（r=0.11）及ⅩP（r=0.16、r=0.04）打分模式，1LJT、4K9G 2 种晶体结构中SP 打分产生了完全相同的线性相关系数，4K9G-ⅩP 取得了最差的线性相关系数（r=0.04），而4K9G-HTVS 取得了最佳的线性相关系数（r=0.50）。对接打分取得了不够理想的线性相关系数，可能是因为表1中ISO-1衍生物的抑制活性差异不够大，同种类型的化学结构没有跨越较大的活性梯度，因此没法较好地进行受体-配体结合亲和力排序。尽管传统意义上，通常认为精度越高的打分函数与实验活性会产生最佳的线性相关系数，但通过MIF 与ISO-1 类似物活性比较，可以发现不同晶体结构、不同精度对接打分会产生完全不同的线性相关性，因此在进行大规模虚拟筛选前，最好将不同蛋白靶点晶体结构及不同精度对接打分对已知抑制剂进行验证，从而挑选相对更合理的晶体结构和打分方法。

图2 2种不同MIF晶体结构、3种不同Glide对接精度的实验与计算活性线性相关图Figure 2 The correlation of two different MIF crystal structures between the experimental log IC50and three docking scores

2.3 4K9G-HTVS 模式对典型ISO-1 类似物进行相互作用分析

通过“2.2”项的线性比较结果发现，4K9G-HTVS模式可以得到最佳的相关系数，所以基于4K9GHTVS模式得到的ISO-1类似物的复合物结构，分析比较文献[30]报道的ISO-1 类似物（表1）中活性最强的化合物16 与最弱化合物9 的相互作用（图3）。从图中可以看出，化合物16 比化合物9 有更强的结合能力，原因可能是化合物16 中酚羟基与Asn97 的羰基氧原子可以形成更强的氢键，化合物16中的羰基和异噁唑环中氧原子可以与Lys32 的胺基形成2个氢键，另外化合物16中的环己烷基团可以与周围的非极性氨基酸（Pro33、Ile64、Trp108、Phe113）等形成疏水相互作用，因此导致化合物16与MIF的结合更紧密。

图3 4K9G-HTVS中化合物9、16的Glide对接构象叠合图（A）；4K9G-HTVS中MIF与化合物9（B）、16（C）的二维相互作用图Figure 3 The superposition of two Glide docked compounds 9 and 16 (A);2D representation of the interactions between MIF and compounds 9,16(B,C)

2.4 高活性ISO-1类似物的理性设计与预测评价

通过以上的理论分析显示，ISO-1 类似物要与MIF形成较强的相互作用，需要保留酚羟基、羰基等核心基团，有助于与Asn211、Ile64、Lys32 形成氢键相互作用。在此基础上，对侧链R进行优化，发现侧链R如果被较大非极性基团取代（如化合物14、16），可以与Tyr36、Trp108 和Phe113 形成更强的疏水相互作用。此外，根据Cheng等［30］的报道，如果在酚羟基的邻位引入卤素原子（如氟原子），ISO-1 类似物活性可以增强约10倍，因此设计了6个新颖抑制剂分子（P1-P6），并且基于前面获得的最优4K9G-HTVS打分模式，对这些化合物进行打分验证，结果显示相比ISO-1，这些类似物与MIF 具有更强的结合亲和力（表2）。另外，采用Schrödinger 软件包中Qikprop 成药性预测软件，预测了这些化合物的分子量、脂水分配系数和水溶性，尽管相比ISO-1 具有稍差的脂水分配系数和水溶性，但也在Qikprop 预测的合理成药性范围之内。Qikprop 预测的具有成药性化合物的合理相对分子质量、脂水分配系数和水溶解度分别为130.0～725.0、-2.0～6.5和-6.5～0.5。

表2 理性设计的6个ISO-1类似物的化学结构及成药性预测Table 2 Chemical structures，docking scores and properties predicted for ISO-1 and six designed compounds

3 结论

本文基于已知的MIF-ISO-1、MIF-ISO-66 晶体结构，采用Glide 中3 种不同精度（HTVS、SP、ⅩP）对接打分方法，比较了不同晶体结构、不同精度打分方法对ISO-1 类似物的结合模式和相互作用。通过比较对接打分与实验活性的线性相关系数发现4K9G-HTVS模式可以获得最佳的受体-配体结合亲和力排序。接着采用4K9G-HTVS 模式，构建了ISO-1 类似物中活性最弱的化合物9 与最强的化合物16 与MIF 的复合物结构，通过分析发现，在R 侧链中引入较大的非极性基团，可能与Pro33、Ile64、Trp108、Phe113 等形成疏水相互作用。在此基础上，设计了6 个新颖的ISO-1 类似物，并采用HTVS打分模式分别对接到4K9G 晶体结构中MIF 结合口袋，理论预测发现，相比ISO-1，这些化合物具有更强的抑制活性。Qikprop 预测显示这些化合物具有较好的成药性。本文结果对于深入了解MIF 与配体的结合模式，理性设计具有更强活性和更好的成药性的ISO-1衍生物提供了理论基础。