HPLC法测定人血浆中头孢噻肟钠浓度及药动学研究

张柏娥 ，戴伟锋 ，付丽，3 ，赵高琼 ，崔佳丽，杨宏博

（1.昆明理工大学，云南昆明 650504；2.云南省药物研究所，云南昆明 650111；3.思维特健康管理有限公司，北京 100010）

头孢噻肟钠（cefotaxime Sodium，CTⅩ）是1977年德国制药公司研发成功的首个第三代半合成头孢菌素类抗生素，其抗菌谱广，对革兰阴性菌、革兰阳性菌、需氧菌和某些厌氧菌均有较好的抗菌活性，特别对革兰阴性菌的杀灭作用更强，广泛分布于全身各组织和体液中，临床主要用于呼吸道感染、尿路感染、胃肠道及胆道感染和眼耳鼻喉感染等，对败血症、心内膜炎、脑膜炎、腹膜炎和皮肤软组织感染等均有很好的疗效[1-3]。自1998 年我国制药公司仿制成功后，已经成为我国临床用抗生素的主要品种[4]。但由于抗生素本身不良反应较多、长期不合理使用产生较强的耐药性等原因，从而给人类的身体健康造成严重威胁[5]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters 高效液相色谱系统Empower 色谱工作站（美国Waters 公司）；BP121S 电子天平（德国赛多利斯股份公司）；LN-9527-01 高速离心机（美国雅培公司）；ⅩW-80A 旋涡混合器（上海精科实业有限公司）。

1.2 材料

头孢噻肟钠（中国食品药品检定研究院，批号：CFTZ180063，质量分数：90.6%）；注射用头孢噻肟钠（哈药集团制药总厂，规格：0.5 g、1.0 g和2.0 g，批号：130220、130312 和130703）；头孢拉定（内标，中国食品药品检定研究院，批号：130427-201707，质量分数：95.7%）；乙腈（色谱纯，美国Merck公司，批号：1428130）；乙酸、二氯甲烷、磷酸等试剂均为分析纯；超纯水利用实验室超纯水机自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Synergi Hydro-RP 80Å 柱（4.60 mm×250 mm，4 μm）；流动相：乙腈-20 mmol/L磷酸水溶液（体积比16∶84）；流速：1.0 mL/min；检测波长：234 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2.2 标准溶液的配制

2.2.1 头孢噻肟钠标准溶液的配制 精密称取头孢噻肟钠对照品55.20 mg 于25 mL 量瓶中，用超纯水溶解后，定容至刻度，按含量折算后即得质量浓度2.000 mg/mL 的头孢噻肟钠储备液，放置于冰箱中冷藏保存备用。试验过程中依据需要，再将头孢噻肟钠储备液稀释成5.000、10.00、20.00、50.00、100.0、400.0、800.0、1 200、1 600 μg/mL的标准溶液。

2.2.2 头孢拉定标准溶液的配制 精密称取20.90 mg头孢拉定对照品于25 mL容量瓶中，超纯水溶解后，定容至刻度，按含量折算得质量浓度为800.0 μg/mL的内标储备液，放置于冰箱中冷藏保存备用。

2.3 血浆样品处理方法

精密吸取人含药血浆200 μL，置于离心管中，加入800.0 μg/mL 头孢拉定溶液20 μL，加入乙腈800 μL，振荡混合均匀，10 000 r/min 离心5 min，上清液加0.3%乙酸溶液10 μL 调pH 值至酸性，加入二氯甲烷1 mL，振荡混合充分，4 000 r/min离心3 min，精密吸取上清液10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录头孢噻肟钠峰面积与内标头孢拉定峰面积。

2.4 方法学考察[12]

2.4.1 专属性试验 精密吸取不同来源空白混合血浆样品200 μL，除不加内标溶液外，其他与“2.3”项方法操作，按“2.1”项色谱条件进样，获得色谱图1A。

精密吸取不同来源人空白混合血浆样品180 μL，加入经储备液稀释的100.0 μg/mL 头孢噻肟钠溶液20 μL，按“2.3”项方法操作，再按“2.1”项色谱条件进样，获色谱图1B。

精密吸取1-01 受试者滴注头孢噻肟钠1 h 时收集的血浆样品200 μL，按“2.3”项方法操作，按“2.1”项色谱条件进样，获得色谱图1C。

对于天然饵料，不同的水库，由于环境条件、水文情况等不相同，天然饵料的种群数量和产量也不一样，有时差别还比较大。天然饵料不丰富的水库，要通过设置人工鱼巢、投放人工培育鱼苗（如鲮鱼），加大鲤、鲫鱼的混养密度等措施，增加杂鱼种群密度。

图1 头孢噻肟钠高效液相色谱图Figure 1 HPLC Chromatograms for CTⅩplasma samples

可见，血浆中头孢噻肟钠和头孢拉定的保留时间分别约为5.9 min 和4.9 min，头孢噻肟钠峰和头孢拉定峰分离度（约为2.5）大于1.5，且不受血浆中内源性物质的干扰，表明方法专属性较好。

2.4.2 标准曲线和定量下限 取180 μL 不同来源人空白混合血浆样品7份，每份分别依次精密吸取加入经储备液稀释的7个不同质量浓度的头孢噻肟钠标准溶液各20 μL，按“2.3”项方法进行操作，得质量浓度分别为0.500 0、1.000、5.000、10.00、40.00、80.00、160.0 μg/mL 的头孢噻肟钠血浆样品和质量浓度为80.00 μg/mL 头孢拉定血浆样品。以上各浓度样品平行操作，按“2.1”项色谱条件进行检测，建立头孢噻肟钠的标准曲线。采用加权（W＝1/X2）最小二乘法，以头孢噻肟钠峰面积与内标峰面积比值（Ai）为纵坐标，以头孢噻肟钠质量浓度（C,μg/mL）为横坐标，进行线性回归运算，求得线性回归方程Ai＝0.026 9C-0.001，R2＝0.998 3。校正标样回算的浓度均在标示值的±15%，最低定量下限（LLOQ）在±20%。由此可见，头孢噻肟钠人血浆样品在0.500 0～160.0 μg/mL范围内线性良好，LLOQ为0.500 0 μg/mL，符合体内生物样品分析要求。

2.4.3 精密度和准确度试验 取空白离心管，精密吸取不同来源人空白混合血浆样品各180 μL，再分别加入经储备液稀释的不同质量浓度的头孢噻肟钠溶液20 μL，按“2.3”项方法进行操作，制成质量浓度分别为0.500 0、1.000、40.00、120.0 μg/mL 的头孢噻肟钠血浆样品。每个质量浓度血浆样品平行制备6 份，且在不同天连续制备3 个分析批次进行测定分析，测定头孢噻肟钠峰面积。结果表明，日内、日间精密度RSD 值均小于15%，符合生物样品检测要求，见表1。

表1 血浆中头孢噻肟钠批内、批间精密度和准确度Table 1 Within-run and between-run precision and accuracy of Cefotaxime Sodium in plasma

2.4.4 提取回收率试验 精密吸取不同来源人空白混合血浆样品各180 μL，再分别加入经标准溶液稀释的不同质量浓度的头孢噻肟钠溶液20 μL，按“2.3”项方法进行操作，制备成质量浓度分别为低（1.000 μg/mL）、中（40.00 μg/mL）和高（120.0 μg/mL）头孢噻肟钠血浆样品各6 份，测定头孢噻肟钠药物峰面积和内标峰面积，并计算其比值，将比值带入标准曲线方程计算实际质量浓度，按下面的公式计算提取回收率：提取回收率＝（测得的质量浓度/实际加入质量浓度）×100%。结果表明，头孢噻肟钠低、中、高质量浓度血浆样品的提取回收率为90.88%～92.41%，符合生物样品方法学考察要求，见表2。

表2 头孢噻肟钠血浆样品提取回收率试验结果Table 2 The recoveries of CTⅩplasma samples(n=6)

2.4.5 残留效应 在最高定量限样本与高浓度样本测定后，随之测定空白样本，评估残留。结果显示，高浓度样本检测后，再测定分析空白样本中的残留不超过LLOQ 的20%，且同时不超过内标的5%，故认为本方法不存在残留效应。

2.4.6 稳定性考察 精密配制质量浓度分别为1.000、40.00、120.0 μg/mL 的头孢噻肟钠血浆样品，考察室温（22±2）℃放置2 h、-80 ℃反复冻融3次和长期冷冻55 d 时头孢噻肟钠在血浆样品中的稳定性，以及进样前室温（22±2）℃放置12 h 的样品稳定性。结果表明，以上3 个质量浓度的头孢噻肟钠血浆样品，在室温放置2 h、-80 ℃反复冻融3 次、-80 ℃长期冷冻55 d 和在处理后室温放置12 h 条件下均较稳定，见表3。

表3 头孢噻肟钠在人血浆中的稳定性考察结果Table 3 Stability of CTⅩin human plasma(n=6)

2.5 药动学研究

2.5.1 志愿者选择及血浆样品的收集 本试验方案经解放军昆明总医院批准后实施，共纳入18名健康志愿者，年龄（24.25±2.49）a，体质量（58.52±8.83）kg，男女各半，无药物过敏史、药物依赖史和慢性疾病史，青霉素皮试阴性，试验前7 d 内未服用任何药品，半年内未参加过任何临床试验，实验室检查各指标合格，均签署知情同意书，体检各指标未出现具有临床意义的异常，符合纳排标准入组试验。

受试者于试验前一天晚10时开始禁食，试验当日晨8 时空腹抽取空白血样后随机分为3 组，各组分别恒速静脉滴注0.5、1.0、2.0 g 经0.9%NaCl 注射液制备的头孢噻肟钠注射液各100 mL，滴注30 min。从开始滴注计时，分别于0.08、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0 h 采静脉血2 mL 至肝素管中，4 ℃保存，3 500 r/min 离心5 min，分离血浆，立即放于-80 ℃冰箱中保存备用。

2.5.2 血药浓度测定 精密吸取上述滴注头孢噻肟钠受试者各时间点收集的血浆样品200 μL，按“2.3”项方法进行平行操作后，利用上述经验证的色谱条件平行测定各血浆样品头孢噻肟钠浓度。

2.5.3 数据处理分析 采用DAS 2.0软件对测定的不同时间点血药浓度结果进行非房室模型（NCA）分析。

2.5.4 药动学参数 通过数据处理分析，计算平均血药浓度，建立平均血药浓度-时间曲线（见图2）。采用DAS2.0 软件进行血药浓度分析，获得主要药动学统计矩参数（见表4），并利用置信区间法[13]对各统计矩参数进行统计学分析。可见，随给药剂量增加，最大血药浓度（Cmax）和浓度-时间曲线下面积（AUC0-t和AUC0-∞）值随之增加；利用置信区间法分析表明，Cmax和AUC0-t在剂量0.5～2.0 g 范围内β的90%置信区间分别为0.79～1.21和0.87～1.04，均落在Cmax和AUC0-t的判断区间0.70～1.43 和0.80～1.25 范围内，表明头孢噻肟钠呈线性动力学特征。

表4 主要药动学参数Table 4 The main pharmacokinetics parameters(,n=6)

表4 主要药动学参数Table 4 The main pharmacokinetics parameters(,n=6)

图2 单次静脉滴注各剂量组头孢噻肟钠平均血药浓度-时间曲线Figure 2 Mean plasma concentration-time curves of different doses of CTⅩafter iv(,n=6)

3 讨论

头孢噻肟钠因具有抗菌谱广、治疗效果好、毒副作用小等特点，在临床应用广泛，而对于其体内血药浓度的监测及其药动学研究国内外文献报道相对较少。本研究建立了一种快速测定头孢噻肟钠血浆样品浓度的HPLC法。为了减少系统误差对测试样品浓度的影响，在方法学研究过程中，对每批样品分析时，将质控样品（1.000、40.00、120.0 μg/mL）均匀分布在未知样品测试顺序中，建立随行标准曲线，从而保证了检测样品的准确性。

本研究建立的HPLC 法，血浆中内源性物质不干扰样品的测定，内标物头孢拉定的保留时间约为4.9 min，头孢噻肟钠的保留时间约为5.9 min。与熊原等[6]和顾宜等[7]的报道比较，虽然样品检测时间大体相同，但样品前处理比较简便。另外，也有文献报道采用内标法测定血浆中头孢噻肟钠浓度，可能由于选择内标物的原因，使待测内标物（分别为咖啡因和3，5-甲苯二酚）检测完成的保留时间分别为10.6 min和12.26 min[8-9]，样品整体的检测时间与本研究的相比，增加约1倍。本研究检测更加快速的原因可能主要有两个方面：首先，优化了血浆的处理方法，采用乙腈蛋白沉淀，0.3%乙酸溶液调pH，二氯甲烷除杂，由于选用的试剂及方法合理，测定时杂质峰干扰少、灵敏度高，操作也简便；其次，内标物的选择，无论本研究还是文献[7，9]报道中，头孢噻肟钠的保留时间基本一致，文献中内标物保留时间在头孢噻肟钠的保留时间之后，而本研究中选择的内标物头孢拉定在头孢噻肟钠保留时间之前，且内标物能与杂质峰可完全分离，大大缩短了每个样品的检测时间。

本研究采用建立的HPLC法测定了单次给予不同剂量（0.5、1.0和2.0 g）时、不同时间点的头孢噻肟钠血药浓度，并对不同剂量/规格的药动学参数进行统计分析，比较不同剂量间药动学参数的差异性，结果表明随着给药剂量增加，Cmax、AUC0-t和AUC0-∞值增加，Cmax和AUC0-t在剂量0.5～2.0 g 范围内β的90%置信区间分别为0.79～1.21和0.87～1.04，均落在Cmax和AUC0-t的判断区间0.700～1.43 和0.80～1.25 范围内，表明头孢噻肟钠3个剂量组Cmax和AUC0-t参数与剂量间具有线性相关，由此提示在临床上静脉注射头孢噻肟钠时，应考虑剂量对人体产生的影响。

本研究仅对单次给予不同剂量的头孢噻肟钠进行血药浓度监测及药动学分析，在今后的研究中，可考虑单用头孢噻肟钠连续给药或与β-内酰胺酶抑制剂组成复方单次/连续给药，综合系统地考察头孢噻肟钠在人体内的药动学特点。