马铃薯晚疫病病原菌的分离及室内药剂筛选

鲁进恒，戴 晋，袁 谦，张中州，刘晓东，范志业

(1.漯河市农业科学院，河南 漯河 462000；2.舞阳县农业技术推广中心，河南 舞阳 462000)

马铃薯是一种粮菜兼用作物，因其适应性强，分布广，被列为全球第三、中国第四大农作物[1]。马铃薯的块茎营养丰富，不仅淀粉含量高，而且富含多种人体必须的维生素和氨基酸[2]，有巨大的社会需求，是一种既可鲜食又可深加工的农产品。河南省作为传统的农耕区，马铃薯一直保有相当的种植面积，特别是近年来，随着农业产业结构的调整，家庭农场的出现，马铃薯因其生产周期短，经济效益高的特点，在本省的栽培面积呈逐年扩大趋势。

晚疫病(Potato late blight)是马铃薯生产中的第一大病害，每年在全球范围造成经济损失约67亿美元[3～4]，对我国造成损失约10亿美元[5]。该病害既能侵染植株叶片也可危害地下茎块，当其初侵染叶片时，会在叶的边缘形成水溃状斑点，病叶被面有霉层，潮湿环境下病状蔓延速度会加快，最后致整个植株呈焦黑状；当其侵染薯块时，会在薯块表面形成灰紫或褐色不规则凹陷病斑，病斑下的薯肉呈深度不同的褐色坏死，直至整块坏死[6]。

漯河市为豫中南重要的粮食和蔬菜的生产及转运基地，马铃薯在当地一直被作为蔬菜种植。由于种植年限长，重茬现象严重，田间积累了大量的病原，晚疫病的发生程度呈逐年加重的趋势。但本地区关于马铃薯晚疫病的相关研究较少，缺乏有效的防治方法，从服务农业生产的角度出发，本课题组对罹患晚疫病的叶片进行了组织分离，将分离纯化得到的菌株进行了致病性测定，并用室内毒力测定法进行了防治药剂的筛选，以期为本地马铃薯晚疫病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料：①马铃薯晚疫病病叶由漯河市舞阳县辛安镇种植田采集；②黑麦培养基(RSA)[7]：黑麦60 g，蔗糖20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1 L。

供试药剂：①80%代森锰锌可湿性粉剂，先正达作物保护有限公司生产，商品名称山德生；②500 g·L-1氟啶胺悬浮剂，日本石原产业株式会社，商品名称福帅得；③23.4%双炔酰菌胺悬浮剂，先正达作物保护有限公司生产，商品名称瑞凡；④46%氢氧化铜可湿性粉剂，美国杜邦公司生产，商品名称可杀得叁仟；⑤250 g·L-1嘧菌酯悬浮剂，先正达作物保护有限公司生产，商品名称阿米西达。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离与纯化 采用薯片夹叶法[8]进行病原菌分离。用无菌水反复冲洗病叶，去除表面尘土后晾干，剪取叶片病健交界处4～5mm2组织块，先置于75%酒精溶液处理3～4 s，后置于0.1%升汞消毒15～20 s，取出用无菌水反复冲洗后备用。将健康薯块洗净并晾干，浸入75%酒精溶液处理10～15 s，取出烧干，切成厚7 mm左右的薯片，取制备好的病叶夹于两薯片中间，滤纸保湿20℃培养，待在薯片上长出霉层，直接挑取霉层置于RSA上20℃培养。5 d后，对菌落进行单孢纯化[9～10]，获得纯化菌株后保存于RSA平板上，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.2 致病性测定 采用菌丝块接种法进行致病性测定[11]。取健康的马铃薯叶片，经无菌水冲洗干净后用75%酒精表面消毒1 min，再用无菌水冲洗残留酒精，置于培养皿中备用，皿中铺无菌纱布保湿。将分离获得的纯化菌株转接于RSA上，于20℃活化培养5 d后，在菌落边缘用直径5 mm的打孔器打取菌饼，用接种针对叶片作刺伤处理后，将菌饼接种到伤口处，以无菌RSA块作为对照，置于20℃培养箱培养(光周期12L∶12D)，每24 h观察一次。待发病后再次从病斑处分离病原菌，并与首次分离的病原菌作对比。

1.2.3 杀菌剂室内毒力测定 利用菌丝生长速率法[12]测定5种药剂对该致病菌的抑制作用。试验准备：依据RSA的配方配制适量的培养基，并将其以50 mL为单位分装灭菌备用，同样准备以100 mL为单位无菌水若干备用。试验过程：先将50 mL的RSA融化，冷却至45℃左右，后加入一定量的药液，分别配成不同梯度的含药培养基，摇匀后倒入直径6 cm的灭菌培养皿中。用直径为5 mm的打孔器将活化好的供试菌种打取菌饼接入含药培养基中央，置于20℃恒温培养箱中。培养7 d后，用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝相对抑制率。

利用DPS软件进行统计分析，求出各药剂对马铃薯晚疫病原菌的毒力回归方程、抑制中浓度EC50、相关系数及置信区间。

相对抑制率( % )= (对照菌落平均直径-处理菌落平均直径)/对照菌落平均直径×100

表1 5种杀菌剂的浓度梯度

2 结果与分析

2.1 分离及纯化结果

由分离、纯化获得分离物，编号为LHW202009。将该分离物接种在RSA平板上，20℃下黑暗培养7d后，可形成圆形或近圆形菌落(图1-A)。菌丝为白色且稀薄，部分老龄菌丝发黄。镜检状态下(图1-B)：菌丝无色无隔膜，孢子囊着生于菌丝膨大的节处，各个分节的长短不均匀。孢子囊呈柠檬形，大小为(2～45)μm×(12～25)μm，一端具乳突，着生端有小柄，易脱落。这些形态与马铃薯晚疫病致病菌——Phytophthorainfestans的形态相吻合。

图1 病原菌菌落形态和孢子形态

2.2 致病性鉴定

将该菌在RSA平板上培养5d后，取菌落边缘的菌丝块接种在健康的刺伤马铃薯叶片上，光周期12L∶12D条件下光照培养箱保湿培养。4d后接种叶片显症，症状与田间调查相同(图2)，均为叶片边缘先发病，开始为一水渍状斑点，后向叶中部迅速扩大。且病斑与健部无明显界限，病斑处有白色绒毛状霉层，叶片背部症状更明显。将接种后发病的叶片进行二次分离，分离获得物与田间分离的病原菌一致，确定该分离物为本地区马铃薯晚疫病致病菌。

图2 马铃薯晚疫病田间症状(A)及接种后的发病症状(B)

2.3 杀菌剂室内毒力测定

从测定的5种杀菌剂对马铃薯晚疫病菌的毒力结果(表2)可知：供试药剂对晚疫病菌株均有一定的抑制效果，但各药剂间差异明显。其中双炔酰菌胺的抑制作用最强，EC50为0.0276 mg·L-1；其次为嘧菌酯，EC50为0.036 mg·L-1，其余被测药剂的毒力大小依次为氢氧化铜、氟啶胺、代森锰锌，EC50分别为0.3234 mg·L-1、0.3948 mg·L-1和7.0385 mg·L-1。

表2 5种杀菌剂对马铃薯晚疫病病原菌的抑制作用

3 结论与讨论

晚疫病是马铃薯生产上的重要病害，可引起叶片枯萎，严重致时整株焦化枯死，已成为制约漯河市马铃薯生产主要因素。试验通过组织分离法分离出了本地区的马铃薯晚疫病致病菌——Phytophthorainfestans。相关研究表明Phytophthorainfestans起源于墨西哥托卢卡河谷[13]，分为A1、A2两种交配类型，两种类型在中国均存在。据国内张铉哲[14]、王文桥[15]、杨志辉[16]等学者的研究报道，A1交配型主要出现在北方地区，A2交配型在南方地区较多。漯河市居中国南北方地理交界带，分离出的致病菌交配类型尚未确定，且不能确定是那种交配类型在本地区占主导，这将是下一步研究探索的方向。

在分离出致病菌的基础上，为了有针对性地防治本地区的马铃薯晚疫病，笔者研究选取了生产中常用的5种杀菌剂对Phytophthorainfestans进行了毒力测定，以筛选出适宜本地区的防治药剂。试验结果表明5种杀菌剂对该致病菌均有一定的抑制作用，但各药剂间差异显著。其中双炔酰菌胺的效果最好，EC50仅为0.027 6 mg·L-1；其次为嘧菌酯，EC50为0.036 mg·L-1。代森锰锌是5种杀菌剂中抑制效果最差的，EC50高达7.038 5 mg·L-1，分析其原因可能为代森锰锌为传统杀菌剂，在本地区常年大量使用，该病原对其产生了抗药性。基于毒力测定结果，参考刘波微[17]、迟会伟[18]、罗建军[19]关于药剂在田间防效的相关报道，在生产中推荐使用双炔酰菌胺和嘧菌酯用于防治马铃薯晚疫病。这两种杀菌剂皆为内吸性杀菌剂，都有活性高的特点，且都有对作物、人、野生动物和环境安全的特点[20～23]，建议两种药交替使用，以减缓抗药性的发生。