三种苦参碱制剂对非靶标生物的毒性研究

吴 迟，孙 田，何明远，蒋红云，张 兰，张燕宁，毛连纲，朱丽珍，郑永权，刘新刚*

（1.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；2.广西思浦林科技有限公司，南宁 530001）

我国是农业大国，农药在生产生活中发挥着非常重要的作用[1]。近年来，随着环保意识的提高和可持续发展的需要，生物农药受到了广泛关注。2020年2月，农业农村部印发的《2020年种植业工作要点》中就包括完善农药登记审批“绿色通道”政策。该政策为生物农药的登记创造了良好的环境[2]，也为生物农药的发展创造了有利的条件。植物源农药历史悠久，具有种类多、作用方式特异、不易产生抗药性、对环境友好等特点[3]，成为生物农药的首选之一。

目前，苦参碱是登记数量最多的植物源农药。根据中国农药信息网[4]，截至2020年10月，获得登记许可且在有效期内的苦参碱农药品种共121个。苦参碱是一种从苦参和苦豆子等植物中提取出的生物碱，具有杀虫、杀螨、杀菌等生物活性[5-7]，在农业领域被广泛关注和应用。目前，关于苦参碱的防控作用国内外均有报道，如苦参碱可用于防控茶尺蠖[8]；对黑腹果蝇成虫具有杀虫活性[9]；能够有效控制棉蚜种群数量[10]；对白蚁具有强烈的拒食作用[11]；对枸杞刺皮瘿螨可达到较好的的防效，且对天敌安全性较高[12]；对苹果树腐烂病防效优异[13]等。

关于苦参碱对环境安全性的研究也有相关报道。豆敏详等[14]研究表明，苦参碱原药对非靶标生物鹌鹑、意大利蜜蜂、家蚕和斑马鱼等均为低毒。然而，在苦参碱加工生产过程中，一般会添加助剂以制成不同剂型，便于田间使用。然而，部分农药助剂中含有多种有害化学品[15]，如有机硅对大型溞的存活、生长和繁殖等都有一定程度的影响，并且是对成年蜜蜂毒性最大的助剂之一[16-17]；壬基酚聚氧乙烯醚可导致斑马鱼胚胎死亡、胚胎畸形，以及限制斑马鱼的生长等[18]。目前，在我国，苦参碱主要登记剂型为可溶液剂、水剂和可湿性粉剂等，但关于苦参碱制剂对生态系统中的非靶标生物的毒性效应研究较少。因此，本研究主要依据GB/T 31270—2014《化学农药环境安全评价试验准则》标准[19]、美国国家环境保护局（EPA）和经济合作与发展组织（OECD）准则[20-24]，分别测定了3种苦参碱制剂对以下非靶标生物——日本鹌鹑（Coturnix japonica）、意大利蜜蜂（Apis melliferaL.）、家蚕（Bombyx moriL.）、斑马鱼（Danio rerio）和大型溞（Daphnia magna）的急性毒性效应，以确定农药助剂是否影响苦参碱对非靶标生物的毒性，并为苦参碱制剂在田间合理使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试农药。0.6%苦参碱可溶液剂，山东拜沃生物技术有限公司；0.5%苦参碱水剂，江西丰源生物高科有限公司；0.3%苦参碱可湿性粉剂，烟台绿云生物科技有限公司；95.0%苦参碱标准品，北京勤诚亦信科技开发有限公司。

供试生物。日本鹌鹑：选用同批孵化出壳的鹌鹑，试验用鸟为30日龄，平均体重为97.2 g；意大利蜜蜂：选择健康无病、大小一致的成年工蜂用于试验；家蚕：品种为“九芙×七湘”，试验用蚕为二龄起蚕；斑马鱼：平均全长为1.92 cm，平均体重为0.065 0 g；大型溞：处于孤雌生殖状态，未出现雄溞和冬卵，试验用溞为培养3代以上、出生24 h以内的非头胎溞。

供试生物的品系和来源如表1所示。依据GB/T 31270—2014《化学农药环境安全评价试验准则》[19]开展的意大利蜜蜂、家蚕、斑马鱼和大型溞参比物质试验结果见表2，其毒性端点值和95%置信限均在可接受范围内，表明试验体系和供试生物有效可靠，可用于急性毒性试验。

表1 供试生物信息

表2 参比物质试验结果

仪器设备。分析天平、半微量天平、便携式pH计、便携式溶解氧测定仪、便携式溶解氧测定仪，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；水质硬度计，上海三信仪表厂；岛津LC-20AT高效液相色谱仪、InertSustain C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm），岛津企业管理（中国）有限公司；旋转蒸发仪，上海力辰邦西仪器科技有限公司；多管漩涡混合器，常州杰博森仪器有限公司；智能人工气候箱，宁波海曙赛福实验仪器厂；不锈钢鸟笼（60 cm×50 cm×40 cm）。

1.2 试验方法

本研究根据GB/T 31270—2014《化学农药环境安全评价试验准则》[19]、EPA和OECD系列准则（No.213、No.214、No.203、No.202）[20-24]，进行供试农药对非靶标生物的毒性效应研究，并建立分析方法对水生生物试验溶液进行真实浓度检测。

1.2.1 非靶标生物毒性试验

鸟类急性经口毒性试验。采用直接灌喂供试农药的方式进行经口染毒。将0.6%苦参碱可溶液剂设置成浓度为25.0、30.8、37.8、46.5和57.2 mg a.i./kg·bw 5个试验处理；0.5%苦参碱水剂和0.3%苦参碱可湿性粉剂受样品含量限制，分别设置了上限浓度为51.0 mg a.i./kg·bw和12.4 mg a.i./kg·bw试验处理，同时设置空白对照组。每个处理为10只鹌鹑（雌雄各半）。染毒后8 h以及随后连续7 d观察鹌鹑的中毒症状与死亡情况，并计算7 d-LD50（半致死剂量）。

蜜蜂急性毒性试验。急性经口毒性：用50%蔗糖水配制试验溶液，将0.6%苦参碱可溶液剂设置成浓度为24.9、29.9、35.9、43.1、51.7和62.0μg a.i./蜂6个试验处理；0.5%苦参碱水剂设置成浓度为3.12、6.25、12.50、25.00和50.00μg a.i./蜂5个试验处理；将0.3%苦参碱可湿性粉设置成浓度为0.625、1.250、2.500、5.000和10.000μg a.i./蜂5个试验处理，同时设置空白对照组。每处理3个重复，每重复10只蜜蜂。取200μL上述试验溶液供蜜蜂取食，根据取食量计算实际染毒剂量，于染毒后24和48 h观察记录蜜蜂的中毒症状和死亡数，并计算48 h-LD50。急性接触毒性：采用0.6%苦参碱可溶液剂和0.5%苦参碱水剂直接染毒。取2.00μL供试农药点于麻醉后蜜蜂的中胸背板处，得到染毒浓度分别为12.1和10.2μg a.i./蜂的试验处理；0.3%苦参碱可湿性粉受剂型限制，设置上限染毒浓度为0.90μg a.i./蜂试验处理，同时设置空白对照组。每处理3个重复，每重复10只蜜蜂，于染毒后24和48 h观察记录蜜蜂的中毒症状和死亡数，并计算48 h-LD50。

家蚕急性毒性试验。采用浸叶法进行染毒。将0.6%苦参碱可溶液剂设置成浓度为10.0、16.4、26.9、44.1、72.3、119.0和195.0 mg a.i./L 7个试验处理；将0.5%苦参碱水剂设置成浓度为2.00×103mg a.i./L试验处理；将0.3%苦参碱可湿性粉剂设置成浓度为0.500、0.825、1.360、2.250、3.710、6.110和10.100 mg a.i./L 7个试验处理，同时设置空白对照组。每处理3个重复，每重复20头家蚕。用50 mL试验溶液浸渍约5 g桑叶，使药液均匀分布在叶面上，取出阴干后，用于家蚕饲喂染毒，于染毒后24、48、72和96 h观察记录家蚕的中毒症状及死亡情况，并计算96 h-LC50（半致死浓度）。

鱼类急性毒性试验。采用静态法进行染毒，试验期间不更换试验溶液。将0.6%苦参碱可溶液剂设置成浓度为1.00、1.24、1.54、1.91、2.36和2.93 mg a.i./L 6个试验处理；将0.5%苦参碱水剂设置成浓度为0.100、0.132、0.174、0.230、0.304和0.401 mg a.i./L 6个试验处理；将0.3%苦参碱可湿性粉剂设置成浓度为0.065 0、0.085 2、0.112 0、0.146 0、0.191 0和0.251 0 mg a.i./L 6个试验处理；同时设置空白对照组。每个处理为7尾鱼，于染毒后6、24、48、72和96 h观察和记录斑马鱼的中毒症状及死亡情况，并计算96 h-LC50。

溞类急性活动抑制试验。采用静态法进行染毒，试验期间不更换试验溶液。将0.6%苦参碱可溶液剂设置成浓度为1.00、1.58、2.50、3.94、6.23和9.85 mg a.i./L 6个试验处理；将0.5%苦参碱水剂设置成浓度为1.05、1.61、2.46、3.76、5.75和8.80 mg a.i./L 6个试验处理；将0.3%苦参碱可湿性粉剂设置成浓度为0.020 0、0.027 6、0.038 1、0.052 6、0.072 5和0.100 0 mg a.i./L 6个试验处理，同时设置空白对照组。每处理4个重复，每重复5只溞，于染毒后24和48 h观察记录大型溞的中毒症状及受抑制情况，并计算48 h-EC50（半抑制浓度）。

1.2.2 仪器条件分析方法建立

采用岛津LC-20AT高效液相色谱仪对苦参碱进行真实浓度检测。色谱条件：色谱柱为InertSustain C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；进样体积为20μL；柱温箱为40℃；流动相为乙腈与0.02%三乙胺水溶液（40.0∶60.0，V/V），流速为1.000 mL/min；检测器为PDA二极管阵列检测器；检测波长为200 nm；保留时间为4.04 min。

前处理方法。采集10.000 mL供试水样于离心管中，加入10.000 mL乙酸乙酯漩涡振荡萃取。加入适量的氯化钠再次振荡萃取，静置分层。转移上层有机相至旋蒸瓶中，重复提取1次。合并有机相，旋蒸至干。吸取1.000 mL乙腈（色谱纯）至旋蒸瓶中，洗涤内壁，过0.22μm滤膜，上机检测。

水样检测。分别在鱼类急性毒性试验和溞类急性活动抑制试验开始和结束时采集试验溶液，并对苦参碱进行真实浓度检测。

1.3 数据分析与毒性等级划分

采用统计软件SPSS 25.0概率回归分析计算毒性端点值，并根据GB/T 21270—2014《化学农药环境安全评价试验准则》判断供试农药对不同非靶标生物的毒性等级。

2 结果与分析

2.1 3种苦参碱制剂对供试生物的急性毒性效应

试验期间，对照组供试生物无死亡或受抑制情况，且未出现任何中毒症状。在日本鹌鹑急性毒性试验中，用0.6%苦参碱可溶液剂处理的日本鹌鹑出现闭眼打盹的症状；在0.5%苦参碱水剂和0.3%苦参碱可湿性粉剂的试验处理组中，日本鹌鹑表现正常，未出现任何症状。在蜜蜂急性经口毒性试验中，用0.6%苦参碱可溶液剂处理的蜜蜂出现失去平衡、行动缓慢、身体蜷缩、双翅张开的症状；在0.5%苦参碱水剂试验处理组中，蜜蜂表现正常，无不良症状；在0.3%苦参碱可湿性粉剂的试验处理组中，蜜蜂出现身体蜷缩和双翅张开的症状。在蜜蜂急性接触试验中，用3种苦参碱制剂处理的蜜蜂均无不良症状。在家蚕急性毒性试验中，用0.6%苦参碱可溶液剂和0.3%苦参碱可湿性粉剂处理的家蚕均出现吐液现象；0.5%苦参碱水剂未对家蚕造成不良影响。在鱼类急性毒性试验中，用3种苦参碱制剂处理的斑马鱼均出现游动缓慢和失去平衡的现象；0.5%苦参碱水剂试验处理组中，斑马鱼还出现了身体弯曲的情况。在溞类急性活动抑制试验中，3种苦参碱制剂对大型溞均造成游动能力减弱的影响。

2.2 3种苦参碱制剂真实浓度检测

分别在鱼类急性毒性试验和溞类急性活动抑制试验开始和结束时采集试验溶液，并对苦参碱进行真实浓度检测。在本实验室条件下，0.6%苦参碱可溶液剂、0.5%苦参碱水剂和0.3%苦参碱可湿性粉剂对鱼类急性毒性试验的浓度偏差的最大值分别为10.00%、15.00%和16.23%，对溞类急性活动抑制试验的浓度偏差最大值分别为11.17%、6.91%和16.01%。苦参碱实测浓度相对稳定，浓度偏差均保持在理论浓度的±20%，因此使用理论浓度计算毒性端点值[25-26]。3种苦参碱制剂对水生生物急性毒性试验的暴露浓度见表3。

表3 水生生物急性毒性试验暴露浓度

2.3 3种苦参碱制剂对供试生物的毒性试验结果

因受样品含量和剂型限制，0.6%苦参碱可溶液剂对蜜蜂接触的毒性试验、0.5%苦参碱水剂和0.3%苦参碱可湿性粉剂对日本鹌鹑和蜜蜂的毒性试验均采用最高剂量进行染毒暴露。结果显示，0.6%苦参碱可溶液剂对蜜蜂接触的LD50值大于12.1μg a.i./蜂；0.5%苦参碱水剂和0.3%苦参碱可湿性粉剂对日本鹌鹑的LD50值分别大于51.0和12.4 mg a.i./kg·bw，对蜜蜂经口的LD50值分别大于29.2和1.1μg a.i./蜂，对蜜蜂接触的LD50值分别大于10.2和0.9μg a.i./蜂。由此可见，3种苦参碱达到最高剂量时未对日本鹌鹑和蜜蜂造成明显的毒害。

除此之外，供试生物的死亡率随苦参碱浓度的升高而升高，呈现出显著的浓度/剂量-效应关系。结果显示，0.6%苦参碱可溶液剂对日本鹌鹑和蜜蜂经口的LD50值分别为42.8 mg a.i./kg·bw和21.1μg a.i./蜂，毒性分别为高毒和低毒。0.6%苦参碱可溶液剂、0.5%苦参碱水剂和0.3%苦参碱可湿性粉剂对家蚕的LC50值分别为44.40、大于2.00×103和3.07 mg a.i./L，毒性分别为中毒、低毒和高毒；对斑马鱼的LC50值分别为1.660、0.213和0.120 mg a.i./L，毒性分别为中毒、高毒和高毒；对大型溞的LC50值分别为3.26、2.47和4.58×10-2mg a.i./L，毒性分别为中毒、中毒和剧毒。3种苦参碱制剂对供试生物的急性毒性试验结果见表4。

表4 3种苦参碱制剂对供试生物急性毒性试验结果

3 结论与讨论

急性毒性试验结果表明，0.5%苦参碱水剂和0.3%苦参碱可湿性粉剂对日本鹌鹑和蜜蜂已达到试验条件下可达到的最高剂量，但未产生明显的毒性效应。0.6%苦参碱可溶液剂对日本鹌鹑的毒性为高毒，对蜜蜂的毒性为低毒。0.6%苦参碱可溶液剂、0.5%苦参碱水剂和0.3%苦参碱可湿性粉剂对家蚕的毒性分别为中毒、低毒和高毒，对斑马鱼的毒性分别为中毒、高毒和高毒，对大型溞的毒性分别为中毒、中毒和剧毒。由此可见，不同的苦参碱制剂对非靶标生物毒性影响存在差异。

苦参碱原药对鹌鹑、家蚕、蜜蜂经口和斑马鱼均为低毒，毒性端点值分别为512 mg a.i./kg·bw、大于3 000 mg a.i./L、1 145 mg a.i./L和85 mg a.i./L[14]。本研究所使用的3种苦参碱制剂对非靶标生物的毒性相对苦参碱原药较高，特别对于斑马鱼和大型溞毒性为中高毒，甚至剧毒。这一结果与川楝素和雷公藤生物碱等植物源农药的毒性结果较为相似，即78%川楝素原药对鹌鹑和蝌蚪均为低毒，但0.5%川楝素乳油对鹌鹑中毒，蝌蚪高毒[27]。95%雷公藤总生物碱对蝌蚪为低毒，但1.0%雷公藤生物碱微乳剂对蝌蚪为高毒[28]。同时也有研究表明，部分化学农药的制剂产品对非靶标生物的毒性高于原药的毒性，如百菌清和双甲脒的制剂产品对蜜蜂的经口毒性至少是原药的4倍[29]；二嗪磷原药对鹌鹑为高毒，但其乳油和颗粒剂产品对鹌鹑则为剧毒[30]；硝磺草酮不同剂型对斑马鱼的急性毒性顺序由大到小依次为：悬浮剂、可分散悬浮剂、水分散粒剂、原药[31]。Caroline等[32]研究表明，部分农药助剂具有增强发育神经毒性、遗传毒性和扰乱激素功能等危害，还可能增强农药制剂对微生物、植物、鱼类和两栖动物的毒性等。姜锦林等[33]调查发现，常用溶剂甲醇、乙醇、丙酮等在低浓度条件下对水生生物慢性影响较小，但甲苯、二甲苯等对生物存在重大慢性风险，表面活性剂可改变细胞膜通透性，造成细胞内容物外渗，影响细胞的正常代谢活动，最终导致细胞死亡，对水生生物产生不利影响。在101种助剂的毒性调查中，发现4%以上的助剂具有中等毒性，玫瑰精、甲苯、二甲苯、环己酮和壬基酚等具有致癌性、致畸性、致突变性、内分泌干扰性、繁殖损伤和神经毒性等健康风险。因此，苦参碱制剂毒性增高可能与其中添加的农药助剂有关。

根据NY/T 2882—2016《农药登记环境风险评估指南》[34]，笔者进行0.6%苦参碱可溶液剂对日本鹌鹑的急性毒性风险评估，得到风险商值最大值为0.074，即该制剂产品对日本鹌鹑的风险可接受。由此可见，农药对环境非靶标生物的危害不仅取决于农药对非靶标生物的毒性危害，还与农药施用后在环境中的暴露浓度有关。尽管不同剂型的毒性差异较大，但鉴于苦参碱易降解，在不同土壤和不同自然水体中的半衰期均不超过15 d[35-36]，在环境中的暴露浓度较低，其风险可接受。

随着人们对环境保护和生态安全等方面的重视，农药助剂的安全性也受到了广泛关注。目前，美国、澳大利亚和欧洲等地区已出台了关于农药助剂的管理和登记办法[37]。我国农药登记管理中虽暂未明确规定农药助剂的信息要求，但已开始加强对农药助剂的管理。因此，在大力开发苦参碱等对环境安全的农药的同时，研究开发和应用毒性低、对环境友好、可增强药效的农药助剂也越来越重要。

综上所述，虽然苦参碱作为植物源农药具有对环境友好的特点，但本研究结果表明，苦参碱制剂对部分非靶标生物毒性较高，可能与农药制剂中添加的助剂有关。因此，在植物源农药的剂型研制中，建议选用更加高效安全的助剂，以避免对非靶标生物造成危害。