双参活血颗粒对PI3K/Akt/mTOR信号通路介导急性心肌梗死大鼠自噬的影响❋

张嘉敏， 杨 莺

(1.辽宁中医药大学， 沈阳 110847； 2.辽宁中医药大学附属医院， 沈阳 110032)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是全球范围内具有较高发病率和死亡率的疾病之一[1]。自噬是真核生物细胞中普遍存在的一种生理现象，是机体在营养缺乏或应激条件下发生的适应性反应，在多重压力下自噬通过清除细胞内无用大分子蛋白和受损细胞器，降解多余产物以维持细胞内状态的稳定，完成对细胞内营养的供给，满足机体新陈代谢需要。此外，自噬还具有参与多种人类疾病发展过程的生物功能[2]。适当的心肌细胞自噬被证实可减轻心肌重构，维护正常的心功能，应对急性缺血缺氧等有害刺激以及保护受损心肌细胞，使其避免发生急性缺血性死亡；异常的自噬可增加心肌细胞死亡风险，加速心肌梗死的进程甚至加重心力衰竭[3]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路在心肌细胞自噬调控中发挥着至关重要的作用[4]。根据心肌梗死发生时的表现特点，其属于中医学“胸痹”“真心痛”“厥心痛”范畴，某些益气活血药可通过抑制自噬的过度表达，保护缺血缺氧状态下的心肌细胞防治缺血性心脏病[5]。本文通过动物实验探讨以益气养阴、活血通脉功能为主的双参活血颗粒对PI3K/Akt/mTOR信号通路介导的急性心肌梗死大鼠心肌自噬的影响，为临床中医药调控自噬治疗心血管疾病的研究提供参考。本研究已通过辽宁中医药大学动物伦理委员会审查，批号21000092019041。

1 材料

1.1 动物

SPF级健康雄性SD大鼠60只，体质量300～340 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号SCXK(辽)2015-0001。饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，无菌饮水及饲料清洁级喂养7 d，适应环境后进行心肌梗死大鼠模型制备。

1.2 药物

双参活血颗粒药物组成：人参10 g，黄芪20 g，麦冬15 g，当归15 g，丹参15 g，川芎20 g，桃仁15 g，红花15 g。采用传统颗粒制备方法，由辽宁中医药大学附属医院制剂室提供。盐酸曲美他嗪片由施维雅(天津)制药有限公司生产，20 mg/片，国药准字20055465。

1.3 主要试剂与仪器

BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号WLA004)、ECL检测试剂盒(货号WLA003)、β-actin(WL01845)、PI3K(WL02240)、Akt(WL0003b)、mTOR(WL02477)、p-Akt(WLP001a)、p-mTOR(WL03694)抗体，购自沈阳万类生物科技有限公司；p-PI3K抗体(货号AF3241)，中国Affinity公司。

DYY-7C型电泳仪(北京六一公司)；H-2050R型超速冷冻离心机(湖南湘仪公司)；ELX-800型酶标仪(美国BIOTEK公司)；DH36001B型电热恒温培养箱(天津泰斯特公司)；HL-B6型小动物呼吸机(北京新利科技有限公司)；MAC1200ST型心电图机(美国GE公司)。

2 方法

2.1 分组与给药

采用随机数字表法将60只大鼠分为正常组(0.9%氯化钠溶液3 mL/次)8只和造模组52只，造模成功后存活40只随机分为模型组(0.9%氯化钠溶液3 mL/次)、西药组(盐酸曲美他嗪片1.90 mg/kg)、中药高剂量组(7.92 g/kg)、中药中剂量组(3.96 g/kg)、中药低剂量组(1.98 g/kg)每组各8只，用药剂量按照动物体表面积换算，造模成功后次日上午8时开始灌胃给药，每日1次，分笼饲养，自由饮食饮水，共连续观察2周后处死。

2.2 模型制备方法

造模大鼠禁食12 h，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射，麻醉成功后仰卧位固定，气管插管连接小动物呼吸机，针状电极插入四肢连接心电监测仪，术中记录大鼠标准Ⅱ导联心电图。钝性分离胸骨左缘肌肉组织后，于胸骨左侧第3肋间逐步剪开肋间肌暴露心脏，在左心耳下缘2～3 mm处结扎冠状动脉左前降支,以Ⅱ导联心电图ST段明显抬高>0.1 mV至少15 min为造模成功标志(图1)。迅速将心脏送回胸腔,确认无出血后依次缝合胸壁，抽出胸腔积气积液，待大鼠恢复自主呼吸后停止呼吸机，送回鼠笼继续饲养。

图1 造模前后大鼠Ⅱ导联心电图变化

2.3 指标检测与方法

Western Blot法检测自噬信号通路相关蛋白表达:取各组大鼠缺血心肌组织加入裂解液，冰上静置5 min，离心后取上清，采用BCA比色法定量检测蛋白含量。分别配置8%、10%、12%、15%的分离胶进行电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，封闭结束后漂洗，与相应的PI3K(1∶500)、p-PI3K(1∶1000)、Akt (1∶500)、p-Akt(1∶500)、mTOR(1∶500)、p-mTOR(1∶500)、β-actin(1∶1000)一抗反应，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜4次，加二抗(1∶5000)37 ℃孵育45 min，TBST充分漂洗后ECL曝光，采用凝胶图像处理系统Gel-Pro-Analyzer软件对目的条带进行灰度分析，各组与内参β-actin比较得出相对光密度值。

2.4 统计学方法

3 结果

图2表1示，与正常组比较，模型组p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平显著下调(P<0.05)，PI3K、Akt、mToR蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，各药物组p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平均明显上调(P<0.05)，其中西药组上调最为显著，中药低、中、高剂量组p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表达具有剂量依赖性，PI3K、Akt、mTOR蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠心肌组织中PI3K 、Akt、mTOR及磷酸化蛋白表达灰度值比较

注：A.正常组；B.模型组；C.中药高剂量组；D.中药中剂量组；E.中药低剂量组；F.西药组；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)，蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)

4 讨论

冠状动脉堵塞是造成心肌梗死的主要原因，这种堵塞致使冠状动脉血流供应减少，持续性缺血缺氧，从而引起心肌功能损伤和不可逆的坏死，严重威胁患者的生命安全。近年来，中医药调控自噬治疗心血管疾病相关研究日渐广泛，多种中药活性成分、多条信号通路被发现，并可参与自噬的调控机制[6]。

PI3K/Akt/mTOR信号通路是调控自噬最为经典的通路。PI3K根据结构的不同主要分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，Ⅰ型PI3K是触发mTOR通路的必要环节，发挥激活mToR蛋白而抑制自噬的作用；Ⅱ型PI3K不作为细胞表面受体下游的经典信号转导子，具体功能尚存在争议；Ⅲ型PI3K则具有可与多种蛋白结合组成复合体共同参与细胞自噬的功能[7]。Akt是

一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，共有Akt1、Akt2、Akt3 3种亚型，属于AGC蛋白激酶家族。Akt是PI3K下游的主要作用靶点，活化后的Akt处于PI3K/Akt/mTOR信号通路的核心位置，在细胞生长、存活、代谢等多种生物学过程中发挥关键作用[8]。mTOR通过形成mTORC1、mTORC2 2个不同的复合物发挥作用，mTORC1可通过影响S6K1等下游效应因子的磷酸化，参与细胞代谢、生长、增殖、分化和自噬的调控[9]。PI3K/Akt/mTOR信号通路在自噬过程的不同阶段可发生相应变化，生理情况下细胞内营养充足，各种细胞因子等信号分子首先与酪氨酸激酶受体结合，进而激活I类PI3K，之后进一步磷酸化PIP2生成PIP3,活化的PIP3作为第二信使将Akt从细胞质聚集至细胞膜，而不能直接磷酸化Akt，需与磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1 (phosphoinositide dependent protein kinase1, PDK1)结合，从而促使Akt磷酸化，p-Akt可直接或间接将信号传至mTOR[10]。mTOR是细胞自噬进程中的主要抑制因子，受PI3K/Akt通路的正向调控，mTOR收到上游激活信号后形成mTOR复合物1(mTOR Complex 1, mTORC1)，激活的mTORC1通过一系列调控，抑制自噬启动因子的活性，发挥抑制自噬的生理效应，即PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活，可抑制自噬进程[11]。而当细胞受到营养缺乏、缺血、缺氧、氧化应激等不利因素的刺激时，均会抑制PI3K/Akt/mTOR通路中多种激酶的磷酸化，诱导细胞发生自噬[12]。

正常情况下的心肌细胞内存在着较低水平的自噬，当心肌细胞处于急性缺血缺氧状态时，受营养缺乏和氧化应激的影响，细胞的自噬水平会适应性上调，从而减轻心肌细胞的损伤，但长期过度的自噬可能通过自我消化加剧心肌细胞的死亡[13]。目前自噬现象对缺血心肌细胞发挥保护作用的具体时间窗尚不明确。

中医认为胸痹的本质是本虚标实，在心肌梗死的中医证型分类中,虚证类最为常见的证型依次为气虚、阴虚、阳虚等,而实证类以血瘀、痰浊最为多见,其次是气滞、寒凝等，所以气虚、阴虚、血瘀和痰浊是心肌梗死的主要病理基础，益气养阴、活血通脉为胸痹的主要治疗原则[14]。本实验选用双参活血颗粒，由人参、黄芪、麦冬、当归、丹参、川芎、桃仁、红花8味药物组成。方中人参大补元气为君药，臣以黄芪助人参益气;麦冬滋养心肺；当归补血行血，为血中之气药；丹参、川芎、桃仁、红花活血化瘀、通脉止痛共为佐药，诸药共奏益气养阴、活血通脉之功，正切合病机。人参皂苷、丹参酚酸B、川芎嗪、黄芪总苷、麦冬皂苷分别是中药人参、黄芪、丹参、川芎、麦冬的主要活性成分。现代药理研究表明，这些具有益气活血的中药有效成分能够参与自噬相关信号蛋白的调控，并对心肌有保护作用。Qin等[15]研究发现，人参皂苷可通过PI3K/Akt/mTOR通路保护受缺氧诱导的损伤心肌细胞。丹参酚酸B能够促进自噬标志蛋白微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(Microtubule associated protein light chain 3-Ⅱ、LC3-Ⅱ)和自噬效应蛋白(Beclin-1)的表达，在急性心肌梗死中发挥着至关重要的保护作用[16]。孙达[17]等认为，川芎嗪能够激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/缺氧诱导因子-1α(Phosphatidylinositol 3-kinase/Protein kinase B/Hypoxia Inducible Factor-1α, PI3K/AKT/HIF-1α)信号通路，改善大鼠急性心肌梗死后心功能损伤和减少心肌细胞死亡。沈莹等[18]通过实验发现，黄芪总苷可通过mTOR信号通路抑制细胞自噬,减轻H2O2诱导的大鼠心肌细胞氧化应激损伤，提高心肌细胞存活率。本研究采用“冠状动脉左前降支结扎法” 成功复制大鼠心肌梗死模型后，模型组p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达降低，提示机体产生保护性应激反应后抑制此条信号通路活化，诱导心肌细胞自噬；经盐酸曲美他嗪、双参活血颗粒干预后，各药物组p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显增高，且双参活血颗粒的干预剂量与蛋白表达结果呈正相关，提示双参活血颗粒可上调PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平，激活心肌梗死大鼠心肌细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制自噬，并随给药剂量的增加该通路被激活程度越高。

综上所述，双参活血颗粒可能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制过度自噬，从而减轻大鼠心肌梗死晚期损伤。本实验存活大鼠数量较少，未能实时、定量的检测各组心肌细胞自噬活性变化，缺少反映自噬活性对于心肌细胞影响的可靠指标，双参活血颗粒如何调控PI3K/Akt/mTOR信号通路介导的自噬以及在心肌梗死中发挥作用都有待进一步研究证实。寻找中医药调节自噬有效靶点，明确中医药如何通过激活适度自噬，抑制过度自噬而减少自噬性死亡的机制，明确细胞自噬在AMI中的具体时间窗，把握自噬水平高低与治疗作用的关系，将为中医药调控自噬治疗心血管疾病提供新的前景。