痰湿型PCOS大鼠卵巢颗粒细胞线粒体功能及Nox1/p-Akt/Glut4信号通路变化的研究❋

丛培玮， 张丽娜， 陈文娜， 尚 冰， 吴兆利

(1.辽宁中医药大学教学实验中心， 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学医学检验学院， 沈阳 110847；3.辽宁中医药大学医史文献研究院， 沈阳 110847；4.辽宁中医药大学针灸推拿学院， 沈阳 110847)

现代中医认为，痰湿阻络可诱发机体糖脂代谢异常，也是痰湿型多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)患者胰岛素抵抗发生的重要原因之一[1]。卵巢颗粒细胞(granulosa cells, GCs)是卵泡的重要组成细胞，GCs通过缝隙连接和旁分泌因子为卵泡卵母细胞的发育和成熟提供能量支持[2]。线粒体是细胞的“动力工厂”，在卵泡发育周期过程中，GCs线粒体通过合成大量腺嘌呤核苷三磷酸(adenine triphosphate, ATP)为卵泡发育成熟提供能量[3，4]。过量脂沉积诱发的氧化应激会损伤GCs线粒体氧化功能，由此引发机体糖脂代谢异常，是影响排卵前卵母细胞质量的重要原因。本研究在前期实验基础上，从痰湿型PCOS大鼠GCs线粒体功能及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NADPH oxidase1, Nox1)/磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B, p-Akt)/葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter protein 4, Glut4)信号通路变化两方面，探讨痰湿型PCOS卵泡发育异常和闭锁的可能发生机制，丰富“痰湿不孕”的科学内涵。本研究已通过辽宁中医药大学动物实验伦理委员会审核，批准号2019YS(DW)-035-01。

1 材料

1.1 动物

SPF级健康雌性SD大鼠42只，体质量85～105 g，4～5周龄，由辽宁中医药大学动物实验中心提供，许可证号SCXK(辽)-2010-0001。实验动物饲养于辽宁中医药大学SPF级动物中心，自由摄食与饮水，饲养环境温度(20±2) ℃，湿度(50±5)%。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM/F12培养基(货号SH30023)，HyClone公司；青链霉素(货号P1400)，北京索莱宝公司；10%胎牛血清(货号SH30070)，Bio-HyClone公司；孕马血清促性腺激素(货号P9970)，天津正江科技有限公司；BCA蛋白测定试剂盒(货号K20316)，TransGen；ATP测定试剂盒(货号201806)，南京建成生物工程研究所；Nox1抗体(货号ab131088)、p-Akt (ser473)抗体(货号ab81283)、Glut4抗体(货号ab654)、GAPDH抗体(货号ab9485)Abcam公司。

JEM-1400透射电镜(日本电子株式会社)；电泳仪/酶标仪(Bio-Rad，042BR14173)；Tanon5200化学发光成像系统(上海天能科技有限公司)；转膜仪(美国伯乐Bio-Rad小型Trans-Blot Turbo Transfer Systerm)；ST16R高速冷冻离心机(美国热电Thermo Sientific)；LKB-1超薄切片机，瑞典LKB生物技术公司。

2 方法

2.1 动物分组及造模

大鼠适应性喂养1周，选取动情周期规律的22只大鼠随机分为对照组10只和模型组12只，模型组给予高脂饲料连续喂养12周，第3周开始每日灌胃来曲唑溶液[1 mg/(kg·d)溶于0.5%CMC-Na溶液中]，连续9周。高脂饲料由辽宁中医药大学动物实验中心配送。对照组给予常规饲料喂养12周，第3周开始每日灌胃0.5% CMC-Na溶液，连续9周。造模结束后，选取动情周期延长的大鼠10只为痰湿型PCOS造模成功模型组大鼠。

2.2 动情周期检测

通过观察阴道脱落细胞涂片鉴定2组大鼠的发情周期。具体操作：用50μL的移液器吸取适量0.9%氯化钠溶液，在大鼠阴道内来回抽吸3～5次。将吸出的液体滴到干净的载玻片上，苏木素染色后置于光学显微镜下观察并记录。于造模结束前10 d开始观察2组大鼠动情间期，每日上午10∶00进行操作。

2.3 标本采集

造模结束后24 h禁食禁水，拉颈断髓法处死2组大鼠，取卵巢组织PBS清洗，冰上去除表面包膜及周围脂肪组织，每组随机选取各2只大鼠的卵巢组织切成约1 mm3小块，2.5%戊二醛固定以备电镜检测，其余卵巢组织用于GCs原代分离与培养。

2.4 GCs线粒体形态学观察

固定24 h后的电镜标本用PBS漂洗，1%锇酸固定，乙醇、丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋聚合，切片机切片(50～60 nm)，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染，透射电镜下观察GCs线粒体并拍片。

2.5 GCs的分离与培养

分离与培养卵巢组织GCs，参照文献的方法并加以改进[5，6]。将卵巢组织放入DMEM/ F12培养基中，37 ℃孵育15 min。解剖显微镜下用1 mL注射器针头刺破卵泡轻轻拍打与挤压，分别收集2组GCs分为对照组和模型组，40 μm一次性无菌细胞筛过滤，收集细胞悬液离心后弃上清，0.4%台盼蓝染色计数，镜下未见蓝染的为死细胞，制成1.0×106/L密度细胞悬液接种于35 mm培养皿中，置于37 ℃、5% CO2培养箱预培养。观察镜下大多数细胞贴壁后即可更换培养液。培养48 h后，0.1%胰酶消化制成单细胞悬液，PBS冲洗2～3次，4%多聚甲醛固定15 min，HE染色可见细胞形态完整，呈多角形、核蓝染，胞浆淡红色并含有许多颗粒即为GCs，贴壁后待用。

2.6 ATP水平测定

ATP检测采用比色法，将培养的对照组和模型组GCs各按5.0×107/L密度接种于96孔板中，应用酶标仪测定各孔吸光度值，根据公式：(测定OD-对照OD)/(标准OD-空白OD)×标准品浓度(1×103μmol/L)×样本测定前稀释倍数÷待测样本浓度(g/L)，计算各孔ATP浓度(μmol/g)，按照说明书操作。

2.7 活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平测定

2组细胞分别用不含血清培养液以1∶1000体积比加载DCFH-DA探针，终浓度为10 μmol/L，按细胞浓度2×104/孔、100 μl/孔接种至96孔板中，37 ℃5% CO2环境孵育24 h，吸除孔内培养液，加入100 μL DCFH-DA工作液，37 ℃、5%CO2中避光孵育30 min，无血清培养基清洗1遍，化学发光免疫分析仪在激发波长488 nm、发射波长525 nm处测定DCFH，经 ROS氧化后的DCF绿色荧光强度，即代表ROS含量的相对吸光度值。

2.8 Nox1、p-Akt、Glut4蛋白表达

采用Western blot法，在培养的对照组和模型组GCs中加入RIPA细胞裂解液提取蛋白。BCA法进行蛋白浓度测定，以50 μg总蛋白上样量计算加样体积行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳后转膜，根据Marker提示分子量切膜，左上角标记。室温下5%脱脂奶粉、TBST封闭液封闭2 h，分别按照1∶1000、1∶1000、1∶1000、1∶2000比例稀释Nox1、p-Akt、Glut4和GAPDH一抗各4 mL，4 ℃摇床过夜；TBST洗膜，1∶2000比例稀释HRP标记山羊抗兔二抗，室温摇床孵育1 h，TBST洗膜，ECL发光液曝光显影。应用 ImageJ软件分析灰度值，利用目的蛋白/GAPDH的方法求得每例组织蛋白的相对表达量。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠动情周期比较圆的白细胞，少量角化上皮细胞和有核上皮细胞。与对照组比较，模型组大鼠动情间期显著延长(P<0.01)。

图1示，对照组可见规则动情周期平均4～5 d。模型组出现不规则动情周期，表现为间期延长，即动情间期连续超过3 d，镜下可见大量小而

注：与对照组比较：bP<0.01；Control(对照组)，Model(模型组)

3.2 GCs线粒体形态学变化比较

图2示，对照组线粒体形态正常，嵴呈条状及环状型，模型组线粒体数量减少，出现明显肿胀，嵴断裂，线粒体呈空泡样改变。

注：左图为对照组透射电镜下线粒体形态，右图为模型组镜下线粒体形态

3.3 GCs中ATP、ROS含量比较

图3示，与对照组比较，模型组大鼠GCs-ATP含量显著降低(P<0.01)，ROS含量(DC荧光强度)显著增高(P<0.01)。

注：与对照组比较：bP<0.01；Control(对照组)，Model(模型组)

3.4 GCs中Nox1、p-Akt及Glut4蛋白表达比较

图4示，与对照组比较，模型组大鼠GCs中Nox1蛋白表达显著增高(P<0.05)，p-Akt、Glut4蛋白表达显著降低(P<0.01)。

注：与对照组比较：aP<0.05，bP<0.01；Control(对照组)，Model(模型组)；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NADPH oxidase1, Nox1)，磷酸化蛋白激酶B (phosphorylated protein kinase B, p-Akt)，葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter protein 4, Glut4)

4 讨论

卵泡闭锁是排卵障碍的直接原因，而GCs损伤是引起卵泡发育异常和闭锁的根本原因之一[7]。一方面GCs与卵泡膜细胞(theca cells)共同产生卵巢激素和分泌细胞因子，另一方面GCs通过复杂的细胞间连接机制介导着卵泡的生长、发育、闭锁和排卵，GCs能量代谢稳定能促进卵泡发育，反之则会导致卵泡闭锁，尤其是在卵泡发育的后期[8]。已有研究表明，高脂代谢产物导致GCs损伤是加剧不孕症发生的直接风险因素[9-11]。

《傅青主女科·种子》言：“妇人有身体肥胖，痰涎甚多，不能受孕者，人以为气虚之故，谁知是湿盛之故乎。”中医认为，肥胖引发痰湿集聚，流注下焦，壅塞冲任胞宫，而致月经稀发不孕，这与现代PCOS患者以肥胖居多的临床表型一致。现代中医研究发现，长期痰湿阻络诱发机体糖脂代谢异常，是PCOS患者体内出现胰岛素抵抗的重要原因[1,12]。临床调查发现，痰湿型PCOS是目前临床高发的PCOS中医证型[13，14]。本研究以痰湿型PCOS大鼠为实验对象，探讨GCs损伤引发PCOS糖脂代谢异常的可能发生机制。

线粒体是细胞的“动力工厂”，葡萄糖、脂肪酸、氨基酸等代谢产物最终都会进入线粒体的氧化呼吸链合成ATP，为细胞提供能量。在卵泡发育周期过程中需要大量能量参与，GCs线粒体功能正常对卵泡发育成熟及女性生育能力的维持至关重要[3，4]。长期高脂饮食导致的血脂异常会诱发低密度脂蛋白沉积，激发机体氧化应激，刺激Nox等生成大量ROS。尤其在低氧环境下，过量的ROS在超过机体自我清除能力范围时会损伤线粒体氧化功能，包括线粒体脂肪酸氧化代谢率降低，丙酮酸氧化磷酸化水平下降等一系列糖脂终端代谢异常[15-17]。因此，高脂介导的ROS生成增多，氧化应激增强会损伤GCs线粒体功能，使ATP合成减少，引发能量供应不足和糖脂代谢紊乱，可能是影响卵泡发育成熟并导致卵泡闭锁的重要原因。

Nox是细胞内非线粒体源ROS生成的主要酶体，胞内过氧化物酶系统中的Nox介导ROS产生的氧化应激越来越受到关注[18，19]。而PCOS大鼠卵巢GCs中Nox活性是否通过线粒体功能来影响卵泡发育和排卵尚不清楚。Nox1主要表达在结肠、血管平滑肌、前列腺及子宫、卵巢中，发挥宿主防御及血压调节的作用[20-22]。课题组前期研究发现[23]，低氧状态下血管内皮细胞Nox1蛋白表达增高是激活细胞氧化应激水平的主要原因，而低氧环境是卵泡发育成熟的微环境。大量研究证实，PCOS卵巢中GCs在低氧状态下出现严重的氧化应激。本次研究发现，与对照组比较模型组大鼠GCs中Nox1蛋白及ROS含量增高，ATP含量降低。由于ATP源于线粒体，因此本实验进一步观察了GCs线粒体形态学变化，结果显示模型组线粒体数量明显减少，出现肿胀、嵴断裂、线粒体呈空泡样改变，表明模型组大鼠线粒体损伤严重。

Akt是Nox1的下游信号，Nox1可通过抑制Akt磷酸化激活，参与组织氧化应激反应[24，25]。课题组前期研究证实[26]，p-Akt/Glut4信号通路是肥胖型PCOS大鼠胰岛素抵抗发生的关键通路。本次研究发现，与对照组比较模型组大鼠GCs中p-Akt、Glut4蛋白表达显著降低。

综上所述，本研究认为高脂诱导的Nox1高表达引发GCs氧化应激的发生，进而损伤了GCs线粒体糖脂代谢功能，这是导致痰湿型PCOS卵泡发育异常和闭锁的可能机制之一。今后课题组将从Nox1与线粒体损伤的相关性展开深入研究。