基于血管病变探讨麦门冬汤治疗系统性硬化症小鼠的作用机制❋

刘紫微， 王振亮△， 杨伟超， 谢 莎

(1.河南中医药大学， 郑州 450046； 2.仲景宛西制药股份有限公司， 郑州 450046)

系统性硬化症(systemic sclerosis，SSc)是一种自身免疫性疾病，以皮肤增厚、组织或器官的局限性或弥漫性纤维化为主要临床表现，80%左右的患者以肢端雷诺现象为首发症状，最终累及内脏出现心、肺和消化道器官病变，常见肺间质纤维化及肺动脉血管病变[1]。目前其发病机制尚未明确，研究表明血管内皮细胞损伤和活化是SSc发病的关键，受累组织广泛的血管病变是本病的病理学特征之一。血管病变常累及小动脉、微细动脉和毛细血管，因血管内皮细胞和成纤维细胞的增生导致血管腔狭窄，进而出现血行瘀阻。

以往研究主要集中于麦门冬汤对SSc患者纤维化与免疫系统的影响。经实验表明，麦门冬汤能通过提高CD4+、CD8+、T细胞含量调节SSc小鼠的免疫机制[2]，而血管病变的相关研究缺如。本次研究通过观察麦门冬汤对SSc小鼠血管病变的改善作用，为其临床应用提供实验依据。本研究已通过河南中医药大学实验动物伦理委员会审查，批号DWLL201808071。

1 材料

1.1 动物

SPF级75只BALB/c雌性小鼠，体质量(20±5) g，5周龄，北京维通利华实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK(京)2012-0001。饲养于河南中医药大学动物实验中心SPF级动物实验室，温度(21±2)℃，相对湿度40%～60%。

1.2 药物

麦门冬汤组成：麦门冬60 g，人参6 g，半夏9 g，甘草4 g，大枣15 g，粳米6 g，由河南中医药大学第三附属医院中药饮片房提供，煎煮浓缩至含生药1 g/mL。麦门冬汤低、中、高剂量组给药量分别为6.5/(kg·d)、13.0/(kg·d)、26.0 g/(kg·d)，以20 g小鼠和70 kg成人体表面积折算系数(0.0026)换算。

1.3 主要试剂及仪器

博莱霉素(Bleomycin，BLM，货号621158)，上海生工生物工程股份有限公司；血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF，货号EIA-2409)、小鼠抗内皮细胞自身抗体(anti-endothelial cell antibodies，AECA，货号EIA-2285)、血栓素B2(thromboxane B2，TXB2，货号EIA-2540)、6-酮前列腺素F1α(6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α，货号EIA-2177)、ELISA定量试剂盒，苏州艾莱萨生物科技有限公司；苏木素染色液(货号G1140)、伊红染色液(货号G1100)，北京索莱宝科技有限公司。

DL-5B型离心机(上海安亭科学仪器厂)；DNP-9052型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；BL29-DG5031型标准酶标仪(北京中世远达商贸有限公司)；LEICAEG1150型组织包埋仪(上海徕卡显微系统有限公司)；LEICAST5020型组织染色机(徕卡显微系统有限公司)；BX51TRF型显微镜(日本奥林巴斯株式会社)；LGG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(合肥艾本森科学仪器有限公司)。

2 方法

2.1 动物分组、造模及给药

75只BALB/c雌性小鼠按随机数字表法分为正常组15只和造模组60只。制备SSc小鼠模型，用10%硫化钠溶液脱去小鼠背部中央皮肤区域1 cm2×1 cm2的毛发并标记注射区域，正常组小鼠每日皮下注射0.1 mL PBS，造模组每日皮下注射0.1 mL BLM注射液(200ug/mL )，持续21 d。造模成功后，与正常组小鼠比较，造模组小鼠注射部位皮肤显著增厚、硬化，皮损区无新生体毛。成模小鼠按随机数字表法分为模型组、麦门冬汤低、中、高剂量组各15只。麦门冬低、中、高剂量组分别灌胃相应剂量的麦门冬汤，正常组和模型组灌胃同样体积的蒸馏水，于每天上午9∶00及下午5∶00灌胃，连续21 d。实验结束时正常组剩余小鼠14只，模型组13只，麦门冬汤低、中、高剂量组各15只。

2.2 标本采集

各组于末次灌胃后禁食不禁水24 h，摘眼球采血法取血，每只小鼠获得全血样本约1 mL，离心后分离出血清和血浆，-80 ℃保存备用。颈椎脱臼法处死小鼠，剪取背部备皮区皮肤，打开胸腔摘取双侧肺脏，迅速浸入10%多聚甲醛固定。

2.3 指标检测与方法

2.3.1 一般情况观测 观测各组小鼠的体质量、色泽、食量以及精神状态、活动情况、造模部位皮肤变化等情况。

2.3.2 苏木素-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色观察小鼠肺组织与皮肤病理形态学变化 各组分别选取厚度为1 cm的固定肺组织，将肺组织和皮肤组织放入包埋盒中，脱水后运用组织包埋仪进行石蜡包埋，切取3 μm的组织切片进行HE染色，封片后光镜下观察小鼠皮肤及肺组织结构。

2.3.3 ELISA检测 严格按照ELISA试剂盒说明书描述方法测定血清中AECA以及血浆中vWF、TXB2、6-keto-PGF1α浓度。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 各组小鼠一般情况

给药治疗后与模型组比较，麦门冬汤低、中、高剂量组皮损程度均得到一定程度改善，其皮肤硬化程度缓解，弹性有所恢复，个别小鼠皮损区有新生体毛，麦门冬汤高剂量组效果最明显。

3.2 各组小鼠皮肤、肺组织病理学比较

图1示，正常组小鼠皮肤正常，无真皮层增厚及棘细胞层增生，未见胶原纤维增生，无炎症细胞浸润。模型组小鼠真皮层及棘细胞层明显增厚，胶原纤维明显增生，可见明显炎性细胞浸润。与模型组比较，麦门冬汤高、中剂量组真皮层及棘细胞层增厚，胶原纤维增生和炎性细胞浸润程度明显减轻，麦门冬汤低剂量组无明显改变。

图1示，正常组小鼠肺泡结构正常，肺血管壁无增厚、无炎性细胞浸润及纤维化改变。模型组小鼠肺泡间隔明显增厚，部分肺泡萎陷、消失，肺血管壁明显增厚，肺间质增厚，大量胶原纤维增生并伴炎症细胞浸润。与模型组比较，麦门冬汤高、中剂量组肺血管壁和肺间质增厚，胶原纤维增生以及炎症细胞浸润程度明显改善，麦门冬汤低剂量组无明显改变。

图1 麦门冬汤对SSc小鼠皮肤、肺组织病理影响比较(HE×200)

3.3 各组小鼠血中AECA、vWF、TXB2、6-keto-PGF1α含量比较

表1示，与正常组比较，模型组小鼠血中AECA、vWF、TXB2含量均明显升高(P<0.05)，6-keto-PGF1α因子含量明显降低(P<0.05)；与模型组比较，麦门冬汤低、中、高剂量组AECA、vWF、TXB2含量均有不同程度降低(P<0.05)，6-keto-PGF1α含量均有不同程度升高(P<0.05)，其中麦门冬汤高剂量组效果最为明显。

表1 麦门冬汤对小鼠血中AECA、vWF、TXB2、6-keto-PGF1α含量影响比较

4 讨论

本研究以“肺朝百脉，输精于皮毛”为切入点，研究系统性硬化症引起的血管病变，通过观察皮肤与肺组织病理切片，检测AECA、vWF、TXB2、6-keto-PGF1α的含量，为中医治疗自身免疫性疾病提供实验依据及治疗思路。

根据SSc的临床表现，其属于中医学“皮痹”范畴[3]，皮毛失养是其主要病机。皮毛发挥正常的生理功能有赖于卫气、津液以及血液的温润与濡养，而卫气的宣发、津液输布以及血液运行皆与肺胃密切相关。卫气、津血皆为脾胃纳运水谷所化之精微，通过肺气宣降外达布散滋养于皮毛。肺胃之性皆喜润恶燥，胃津不足，腐熟通降无权，卫气、津血化生失常，不足以濡润皮毛；肺热津涸，宣降失常，不能行卫于表、敷津于肤、运血于皮，且肺朝百脉失常，行血力弱易生瘀滞；若久病不愈则更易感邪。正如《素问·痹论篇》所言：“皮痹不已，复感于邪，内舍于肺。”麦门冬汤为治疗“气火上逆，肺胃阴虚”证的代表方剂，用于治疗肺胃津液耗伤、虚火上炎、熏灼于肺之证。方中麦门冬为君，以甘寒清润之性益肺胃之阴以清其虚热；人参为臣补脾益肺、益气生津；粳米补中益气兼止烦渴；大枣养胃健脾补中；生甘草清热补脾润肺、调和诸药，三者配伍与人参相佐，共以“培土生金”之法使肺津源泉不竭；少佐温燥之半夏，降气止逆之余又防滋腻壅滞[4]。诸药并用共奏清养肺胃、降逆下气之功，胃和脾运则卫气津血源泉不竭，肺润宣通则气畅津布、血行畅运，卫气津血达散无阻。

SSc是以自身免疫和炎症、众多血管床中的小血管功能和结构异常导致皮肤和脏器进行性间质改变以及血管纤维化为主要特征[5]。由自身免疫反应导致的血管损伤是SSc发生发展的关键环节，血管内皮细胞(endothelial cells，EC)是其发病的主要靶细胞[6]。AECA是一种以EC表皮异质性抗原为靶标，通过补体介导或抗体依赖细胞毒性破坏血管内皮细胞，以致血管损伤的自身免疫性抗体，是反映血管内皮细胞受损和血管炎的分子标志物[7]，其细胞外基质成分被发现与雷诺现象和SSc密切相关[8]。AECA介导内皮细胞和皮肤成纤维细胞活化，导致SSc的发生并定义了SSc的进程[9]。vWF是一种主要由EC合成的高分子血浆糖蛋白，在黏附聚集血小板于受损内皮过程中具有关键作用[10]，既是血管内皮损伤的一个敏感指标[11]，又是激活凝血机制的重要因素。血管内皮损伤后，vWF起首要作用，受损血管的内皮下成分首先与血液循环中的vWF结合，介导血小板的黏附，扩大血小板聚集，使抗纤溶因子释放增多，纤溶系统被抑，同时利于凝血酶生成，加强凝血机制，导致微循环障碍[12-14]。有研究表明，在风湿病并发雷诺现象的发病机制中，vWF表达水平与雷诺现象发生率呈正相关，且vWF释放越多SSc患者预后越差[11]。血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)是血小板合成的强血管收缩剂和血小板聚集诱导剂，前列环素(prostacyclin，PGI2)是EC合成的强血管扩张剂和血小板聚集抑制剂。血管内皮未受到损伤时两者保持动态平衡，以维持血管的正常张力；血管损伤后使得止凝血与抗凝血机制失调，血管壁PGI2合成酶活性受抑则PGI2生成减少，血小板聚集则TXA2合成增高，且TXA2/PGI2比例失调[9,15]。由于TXA2和PGI2生物半衰期极短，TXB2与6-keto-PGF1α是TXA2与PGI2迅速转化形成的稳定而无生物活性的一对调节血管舒缩因子，所以一般通过测定血浆中TXB2和6-keto-PGF1α间接反映其含量[16]。SSc患者血管异常收缩痉挛、血液呈高凝状态是发生雷诺现象的重要原因。研究发现，SSc患者的TXB2含量显著升高，6-keto-PGF1α显著降低，且TXB2/6-keto-PGF1α数值越高则患者雷诺现象越严重[17]。故TXB2和6-keto-PGF1α与SSc关系密切，以两者的含量反映SSc引起的血管损伤程度极具意义。

本研究表明，麦门冬汤可能通过降低血清中AECA的含量，阻碍AECA与EC结合，防止EC被破坏，从而减轻血管损伤；可能通过减少血浆中vWF与TXB2含量，增加6-keto-PGF1α含量，减轻血管内皮血小板聚集与血管痉挛收缩，促进纤溶抑制血栓的形成，从而缓解微循环障碍，减轻由SSc引起的雷诺反应。麦门冬汤的剂量浓度与治疗效果存在一定的量效关系，表明麦门冬汤浓度越高治疗效果越好，但何时达到最佳疗效仍有待进一步研究。实验时通常要设置阳性对照组，以证明此治疗方法优于或等效其他药物，因此确定麦门冬汤治疗系统性硬化症的最优剂量浓度，且是否优于现已知的临床常规治疗药物是进一步研究的方向。综上所述，麦门冬汤治疗SSc机制之一可能与减轻血管损伤、缓解SSc患者血管病变有关。