脐带间充质干细胞经TLR4-NF-κB通路诱导产生regDC治疗急性肝衰竭

王琳 吴慧丽 肖兴国 张磊

急性肝衰竭(acute hepatic failure, AHF)为免疫紊乱出现导致严重肝功能衰竭的临床症候群，但其发病机制尚未完全阐明，目前认为DC、T淋巴细胞等参与了AHF的发病[1]。Toll 样受体(Toll-like receptors，TLR)与炎症反应的关系研究很多[2]。间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSC)已应用于治疗AHF[3]，但治疗机制尚不清楚。本实验选取5例AHF患者外周血DC与hU-MSC共培养，体外观察hU-MSC对患者单核细胞衍生的DC免疫调节作用，以期为AHF的临床治疗提供新的思路。

资料与方法

一、入组病例

筛选郑州大学附属郑州中心医院消化内科2016年1月至2019年1月5例急性肝衰竭患者。急性肝衰竭诊断标准按照中华医学会感染病学会肝衰竭与人工肝学组与中华医学会肝病学分会重型肝病与人工肝学组发布的《肝衰竭诊治指南(2018版)》[4]。本研究经郑州大学附属郑州中心医院伦理委员会批准，所有研究参与者均签署知情同意书。

二、方法

(一)hU-MSC的分离与培养 无菌条件下采集郑州大学附属郑州中心医院行剖宫产的足月胎儿脐带，分离获得脐带wharton胶组织，剪碎，0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化4 h后200目筛网过滤。收集滤液，1 700 r/min、离心8 min，重悬细胞沉淀接种于培养瓶中，在37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养，第三代收集细胞进行表型鉴定、成脂成骨染色。

(二)人外周血单核细胞分离及DC体外诱导 取患者肝素抗凝外周静脉血20 mL，Ficol法分离得到白膜层，PBS洗涤细胞2次，收获PBMC。用含10 ng/mL GM-CSF、5 ng/mL IL-4和10%FCS的RPMI-1640培养基重悬细胞，37℃，体积分数为0.05的CO2培养箱培养；隔天半量补液，培养5 d备用。

(三)hU-MSC与DC共培养 hU-MSC融合80%时，加入丝裂霉素C(10 μg/mL)，37℃孵育4 h，PBS洗涤2次备用。收集培养第6天的DC，与处理后的hU-MSC按照10∶1混合培养于含有100 ng/mL TNF-α和10%FCS的RPMI-1640培养液中，48 h后收集细胞，进行流式表型鉴定。

(四)DC流式标记和检测 取1×105细 胞于流式管，加入FITC-Lineage Cocktail 1、PE-anti-hunan HLA DR、APC-750-anti-human CD11c、APC-anti-human CD80或 APC-anti-human CD86，抗体用量按照说明书推荐量使用，标记总体积为100 μL。设置同型对照管，加入相同浓度的同型对照抗体。

(五)多因子检测 采集24 h hU-MSC与DC共培养细胞上清液，使用LEGENDplex自定义11细胞因子检测板，根据说明书分析以下11个因子：IL-1β、IL-1α、IL-2、IL-6 、IL-10、TNF-β、IFN-γ、IL-17A、IL-12p40、IL-4和TNF-α。实验重复进行，以确保加载标准。最后用Cytoflex流式细胞仪(Beckman Coulter，Krefeld，美国)进行分析，数据通过Legendplex V8.0软件(Biolegend)进行分析。

(六)蛋白质印迹检测 收取DC，加入细胞裂解液 Buffer(62.5 mmol/L Tris-HCl，2% SDS，10% 甘油，50 mmol/L DTT，1 mmol/L Na3VO4，cocktail proteinase inhibitor，0.01%w/v 溴酚蓝)匀浆，经超声破碎后，SDS-PAGE电泳，转膜，分别与 NF-κB-p65、IKKα及TLR4抗体4℃孵育过夜，HRP标记的相应二抗37℃孵育90 min，ECL 显影，凝胶成像系统观察拍照。

(七)全转录组测序及差异分析 提取5例患者共培养前后DC总RNA，选取其中RNA完整且同时量足够的3例患者RNA，去除 rRNA，探针法纯化rRNA并进行片段化。应用非接触式全自动超声波破碎仪，将RNA打断成100～300 bp，反转录合成cDNA并构建文库。利用 T4 DNA 连接酶将 illumina 测序接头连接至文库 DNA 两端，进行文库片段筛选。采用 Illumina 高通量测序平台，2×150 bp 双端测序策略对文库进行测序。采用Deseq2软件分析两两分组的case 组与 control组的差异表达基因。

三、统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件。2组间数据采用两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、hHU-MSC的生物学特性及鉴定

观察第3代hU-MSC呈成纤维样，细胞大小与形态均一、排列有序定向分化(图1A)。实验结果显示hU-MSC可成功诱导分化为脂肪细胞(图1B)和骨细胞(图1C)。流式细胞仪检测hU-MSC表面标记显示，CD90、CD105、CD73为阳性表达，阳性率分别为94.38%、99.86%、99.86%，而CD19、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR为阴性表达,符合国际上对hU-MSC的界定。

A：第3代hU-MSC；B：脂肪细胞；C：骨细胞

二、DC细胞形态

1. imDC：培养第3天时，细胞周边出现较短的树突状突起，且细胞呈现聚集生长，并且此现象随时间增加愈发明显，此时形成的细胞即为 imDC；2. maDC 形态(图2A)：向 imDC 中(培养第 4～5 天)加入 TNF-α后成簇的imDC逐渐分开，细胞体积变大，细胞外突起增多、变长，此时即形成 maDC；3. regDC形态(图2B)：共培养后发现imDC粘附生长，形态与maDC相比有一定差别，新细胞树突较少，在TNF-α的作用下，形态没有大的改变。

三、DC细胞表型鉴定

imDC高表达CD11b，低表达CD11c，共刺激分子CD80、CD86的表达也相对比较低，I-A的表达量也不高；maDC高表达I-A，共刺激分子CD80和CD86的表达量较 imDC高，但是其低表达CD11b；regDC高表达CD11b，低表达共刺激分子CD80、CD86，二类分子I-A的表达量较低。regDC的表型具有CD11b high CDIa low CD11c low的特点，与maDC相比，共刺激分子CD80、CD86呈低水平表达，与imDC比较相像。 与对照组相比，共培养组DC的表型具有 CD11b high Ia low CD11c low的特点，与maDC相比，共刺激分子 CD80、CD86 呈低水平表达，与 imDC比较相像(图3)。

图3 流式细胞术分析DC及hU-MSC+DC组表型

A：maDC；B：regDC

图2 hU-MSC共培养诱导FHF患者外周血DC形态(×100)

四、LEGENGplexTM多因子流式检测

MSC与DC细胞共培养后，检测了DC细胞因子的分泌情况MSC-DC组IL-10、IL-12p40表达水平较对照组明显增多，IL-1α 、IL-1β和IL-6 表达水平较对照组明显减少(表1)。

表1 DC与hUC-MSC共培养前后细胞因子表达的比较(pg/mL，±s)

五、蛋白质印迹检测TLR4、IKKα与NF-κB-p65蛋白表达变化

hU-MSC共培养组NF-κB-P65与TLR4表达水平明显低于对照组，而IKKα蛋白表达高于对照组；NS398处理组NF-κB-P65与TLR4表达水平明显低于共培养组及对照组，IKKα蛋白表达明显高于其他两组，差异均有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 TLR4、IKKα与NF-κB-p65蛋白表达水平(±s)

六、全转录组测序分析MSC处理后的DC基因表达谱的改变

MSC与DC共培养后对FHF患者外周DC有一定的影响，选取5例患者MSC-DC，以每例患者非MSC共培养组DC为对照组，进行全转录组测序，比较两组全部表达差异的基因。MSC-DC和DC组共有2 790个表达差异的基因(≥2倍，或≤0.5 倍)。与DC组相比，MSC-DC组分别有2 127个上调表达的基因，663个下调表达的基因(图4)。

注：红色表示样本相对于对照样本表达量上调的基因，绿色表示下调基因，蓝色表示无显著差异的基因

图4 差异基因表达火山图

讨 论

MSC已被证明可以干扰DC的分化，MSC具有抑制单核细胞分化为未成熟DC的能力，并且这种抑制作用是可逆的[5]。有研究表明，与MSC共培养的DC，即使暴露于成熟因子，仍不表达CD83，并且未能表现出成熟标志物，如MHCⅡ类分子，CD40或CD86的上调[6]，与本研究结果一致。表明MSC抑制DC的分化，导致未成熟DC的形成，并表现出抑制功能或抑制性表型。

DC在AHF的发病机制中分为两个阶段：①DC的前体细胞即单核细胞迅速进入血液循环；②DC迁移至受损的肝脏组织并被活化，并分化为成熟的DC，同时活化淋巴结中的T细胞使其向受损的肝脏迁移。LPS诱导的肝脏DC细胞活化，并分泌大量TNF、IL-4、IL-5等，在AHF发病中起关键作用[7]。而调节regDC也是免疫反应的关键细胞。本研究发现MSC诱导的regDC表现出髓系分子CD11c、提呈分子Ia和共刺激分子CD80、CD86表达下调，而CD11b的表达上调，这表明MSC诱导出了一种不同的DC群体。本研究显示，MSC-DC组分泌的IL-1α、IL-1β、IL-6降低，但IL-10增加，这是regDC群体的一个特点。由于体外诱导DC分化成熟需要IL-4和TNF-α，因此目前无法分析这两种因子的促炎作用，但是提示MSC可以通过调节DC的分化进而分泌抗炎细胞因子、抑制促炎细胞因子行使免疫调节作用。

TLR作为一种重要的PRR，主要表达于DC细胞表面，构成机体抵御病原体入侵的第一道屏障[8]。LPS与TLR4结合后，通过受体本身胞内段的结构域募集接头分子MyD88，活化IKKα、IKKβ、IKKγ，最终激活NF-κB转录因子，相关促炎性细胞因子TNF-α、IL-6 、 IL-1β和趋化因子，对病毒进行原始攻击,发挥天然免疫的作用，同时促进DC的成熟，从而启动获得性免疫[9]。有研究表明，COX-2 抑制剂发挥抗炎和抗增殖作用主要通过抑制转录因子NF-κB或AP-1的负反馈调节来减弱NF-κB的表达[10]。本研究结果表明，共培养后，NF-κB-p65与TLR4蛋白水平表达明显下降，而IKKα由于组蛋白修饰减少而表达量上调，以NS398阻断NF-κB 下游基因COX-2表达的条件下观察hU-MSC对DC的调节作用，结果发现由于负反馈调节机制, NF-κB-p65与TLR4蛋白表达继续呈现下调趋势，而IKKα蛋白表达再次显著上调。提示hU-MSC可能通过调节AHF患者DC的分化成熟进而影响与TLR4的结合，从而导致IKKα激活的减少，使得NF-κB-p65丝氨酸635磷酸化受阻，最终阻断NF-κB通路影响炎性因子的产生。

本研究通过全转录组测序筛选出上调表达TOP20的基因中有八个与炎性因子负调控明显相关。这些差异表达基因有助于优化治疗方案，选取可用于诊治的基因做进一步研究。

综上所述，hUC-MSC通过TLR4/NF-κB/COX-2信号通路抑制DC的分化及成熟，产生regDC进行免疫调节，同时抑制炎性因子和炎性介质过表达，促进抗炎因子表达，有效降低全身炎症反应发生率，最终缓解急性肝衰竭的进展。