体细胞克隆及胚胎移植技术在优质基因种猪群快速扩繁中的应用

陈海云 林晓 滕丽琼 苏院司 梁启贤/南宁壮博生物科技有限公司 530007

体细胞克隆及胚胎移植技术是一种优质的种猪育种技术。种猪行业在猪只养殖行业的上游，拥有猪只繁殖所需的资源与技术，对整个猪只养殖行业极为关键。

根据国家统计局最新数据显示，2021 上半年全国生猪存栏4.4 亿头，能繁母猪存栏4564 万头。2018 年，2019 年受到非洲猪瘟影响，种猪市场规模经历大幅衰退。2019 年末以后，全国各地对猪肉的需求上升，预计2021 年市场规模可达到865 亿元。我国每年超过97%的核心纯种猪依赖进口。我国育种水平低，国内种猪业长期处于“引种—扩繁—销售—退化—再引种”恶性循环模式。常规育种几年甚至十几年才能培育一头特级公猪。而运用体细胞克隆及胚胎移植技术一年可以获得上百头甚至上千头的特级公猪。实现优质种猪的快速扩繁，大大提高效率，降低了育种成本。

体细胞克隆技术技术原理是从特级种猪采集少量的耳朵组织体外培养，提取细胞核。选取供体母猪卵巢，提取卵母细胞，去掉细胞核，获得去核卵母细胞。进行体外融合、体外培养3d，后进行胚胎移植，114d 左右即可获得克隆后代。现如今研究猪的克隆与基因编辑技术结合，体细胞克隆及胚胎移植技术的改进与提升是该研究的前提。随着猪的繁殖生物技术的需要，猪胚胎移植技术是猪生产中不可或缺的技术环节，是猪繁殖和改良的重要手段。

相比于诱变育种，杂交育种等这类传统育种方式，将体细胞克隆及胚胎移植技术相结合，能够生产出更优质的种猪且耗时少，成本低。对猪的基因组进行修饰，能够生产出抗病性强的猪。生产出来的优质种猪，就可以进行保种保育，防止其优良品系的流失。该技术能生产出高品质的肉猪，抗病能力更强，肉质好又健康。

1 材料与方法

1.1 试验动物由广西壮族自治区南宁市壮博生物科技有限公司提供的长白猪母猪13 头，猪重均在 200 kg 左右，术前检查身体状况健康，良好。采猪的咽拭子进行病毒检测，结果为阴性后禁食 24h，可以喝少量的水。

1.2 胚胎此实验的卵母细胞在南宁市的屠宰场中选取，在该屠宰场母猪的猪卵巢中获取并培养，体细胞用的是五指山猪耳细胞，胚胎由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供。

1.3 试验器材及药品常规外科手术器械；盐酸肾上腺素注射液，购自遂成药业；盐酸利多卡因注射液，购自遂成药业；酚磺乙胺注射液，购自华牧动物保健品；待孕母猪筛选表；开口导管与适配器等。

1.4 麻醉与消毒母猪保定确实后，在耳静脉消毒后注射麻醉药；大约注射40mL 麻醉药后，母猪开始晕眩，大约注射50mL 麻醉药后，母猪倒地。其中有母猪在注射完50mL 还继续强烈挣扎，继续注射达60mL。手术时助理监测记录各环节母猪心跳频率，耗时，用药量与体征状况。

1.5 术式手术前将母猪麻醉倒地，麻醉完成后，用听诊器探测母猪的心跳频率，心跳频率均大致在80Hz 左右为正常。消毒母猪腹部，在接近腹中处用手术刀切开一个大约8cm 左右的口子，手术过程中4 人分别按压猪的腿部，1 人消毒腹腔刮毛后，将手伸入腹部内准确拉出输卵管伞，用生理盐水冲掉溢出的血。术者铺开输卵管伞并捋直输卵管，这时，另一个助手在立体显微镜下找出胚胎，在医用注射器套上约20cm 导管，吸入约200 枚左右的胚胎，植入输卵管伞的一侧子宫。移植完毕后将器官放回腹腔正确位置，用针线缝补好伤口，然后涂抹头孢，再喷涂血云南白药，用纱布包好伤口。整个手术过程高效快速，每台胚胎移植手术不超过10min。

图1 手术过程

1.6 术后护理手术后，注意观察受体母猪手术恢复情况，防范手术伤口感染。每天测量体温2 次，在伤口处涂抹头孢与鱼腥草混合物，1d 1 次，连续3d，如无异常，3d 拆外面的纱布，7d 拆皮肤上线，拆后涂紫药水，防止发炎。对受体母猪进行细致管理，时刻注意受体母猪的环境卫生，身体状况，进食情况以及调整饲喂量。

1.7 妊娠诊断

25d 后使用 B 超进行妊娠诊断，第一次诊断间隔25d，第二次诊一次诊断间隔55d 左右。

2 结果

手术完成后，初步观察到13 头受体母猪在手术后的3d左右，食欲减退不主动吃食，4d 后母猪食欲、体温与精神状态均恢复正常，一个月后进行B超检查，发现有9头母猪妊娠，1 头流产，耳号193602 母猪流产，耳号309001 和333402 移植母猪已超预产期，分别注射氯前列醇钠2 支，未见有小猪产出。本次移植母猪13 头，实际产仔5 头母猪，164101，039604，307105，187201，034904，总产21 头。克隆小猪编号703 由于体重太低（0.37kg），不能吃奶，吞咽困难，已死亡。还有的猪仔的舌头比较大，不能自主吸奶，体质较弱。本团队尚未查到相关资料说明克隆猪舌头偏大的原因，还需进行相关的研究。

表1 试验猪的生产情况

3 讨论

综上所述，应用胚胎移植技术只需要简单的保温设备，一次手术耗时不到10min，相比于普通育种模式有显著优势。不仅节约开支而且防止了各种病原的传播。应用体细胞克隆及胚胎移植技术还需要投入更多的研究，才能更好的保证代孕分娩率与后代存货率。在后续的实验中需优化实验方案，提高团队的技术水平，配套基因测序技术保障供体质量，显微操作克隆技术提高效率，母猪的情期管理技术及胚胎精准着床技术提升代孕分娩率。体细胞克隆及胚胎移植技术的应用前景广阔，未来可期。