蒲地蓝消炎口服液及纯化水中洋葱伯克霍尔德菌检查方法的研究

杨学芳 蔡蓉

（济川药业集团有限公司，江苏 泰兴 225441）

蒲地蓝消炎口服液是由蒲公英、苦地丁、板蓝根、黄芩四味中药配伍，经提取、配制而成的中药复方制剂，具有清热解毒，消肿利咽的功效，主要用于疖肿、腮腺炎、咽炎、扁桃体炎的治疗[1，2]。近年研究表明，蒲地蓝消炎口服液治疗小儿手足口病[3]、急性上呼吸道感染[4]、口腔溃疡[5]、疱疹咽炎[6]等效果明显。王伟伟等[7]研究发现，蒲地蓝消炎口服液联合奥司他韦治疗小儿病毒性肺炎疗效较好；赵东铎[8]研究则表明，利用标准三联疗法+蒲地蓝消炎口服液治疗幽门螺杆菌感染性胃炎的疗效及安全性均良好。可见，蒲地蓝消炎口服液在消炎、抗病毒方面效果突出。

蒲地蓝消炎口服液的质量标准中，依据药典制剂通则，分别对总菌及控制菌（大肠埃希菌）进行了控制，满足了《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》对微生物限度控制的基本要求。但对非无菌药品而言，尤其是水制剂，未对其他潜在的微生物做进一步的研究。洋葱伯克霍尔德菌（Bcc.）（即为水制剂产品中具有潜在危害的一类微生物，目前被定义为不可接受微生物，其耐受消毒剂和抗生素，并能在水基质的非无菌药品中能够存活甚至繁殖，尤其对免疫力缺失或低下的用药人群存在较高的健康风险[9]。美国FDA 从2017 年就发布通知，建议制药企业关注在非无菌水基质药品中不可接受微生物洋葱伯克霍尔德菌群的污染风险。而我国，也曾屡次出现过因洋葱伯克霍尔德菌引起的感染病例[10，11]，并有研究报道了其耐药性分布情况[12-14]，正是由于其在重症监护室的感染率逐渐上升以及强大的耐药性，引起了人们的高度重视。

美国药典USP 中明确指出，用于吸入或口服、口服黏膜、皮肤或鼻腔使用的含水制剂需要检查是否含有洋葱伯克霍尔德菌[15]。对于中药液体制剂而言，因其含水量高容易助长微生物的生长繁殖，导致霉变、酸败等现象，严重者则造成药物的安全性问题[16]，故应加强微生物指标控制。本研究旨在建立蒲地蓝消炎口服液及其制药用水（纯化水）中不可接受微生物洋葱伯克霍尔德菌的检查方法，以此来加强从源头到成品的整体控制，降低致病菌污染风险，提升产品质量控制水平，保障公众用药安全。

1 仪器与试药

1.1 仪器 HR1200-ⅡB2 生物安全柜（青岛海尔）；BSC-1000ⅡB2 生物安全柜（苏净安泰）；HPX-Ⅱ-400 生化培养箱、SPX-400-Ⅱ生化培养箱（上海跃进）；ASM-0.6安瓿水浴灭菌器（山东新华）。

1.2 试剂与药品 洋葱伯克霍尔德菌（菌株编号：ATCC25416），来源于美国菌种保藏中心；蒲地蓝消炎口服液（批号：2011126，10 mL/ 支）和纯化水（批号：210223），均为济川药业集团有限公司自制；胰酪大豆胨液体培养基（德国默克）；胰酪大豆胨琼脂培养基（德国默克）；洋葱伯克霍尔德菌选择性琼脂基础培养基（BCSA，北京三药）；BCSA 选择性添加剂（北京三药）；pH7.0 无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液（青岛海博）；麦氏比浊管（广东环凯）。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 接种洋葱伯克霍尔德菌至10 mL 胰酪大豆胨液体培养基中，30 ℃培养45 h。取上述培养物用麦氏比浊管比浊确定浓度，再用pH 7.0 无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液10 倍系列稀释至约1～100 cfu/mL。取含菌量1～100 cfu/mL 洋葱伯克霍尔德菌悬液1 mL 至2个平皿中，加胰酪大豆胨琼脂培养基并摇匀，30 ℃培养48 h，计数结果见表1。

表1 菌液制备菌种计数结果

2.2 供试品溶液制备 取供试品（蒲地蓝消炎口服液、纯化水）10 mL，加pH 7.0 无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液90 mL，制成1∶10 的供试液。

2.3 检查方法 取1∶10 的供试液，采用平皿法进行洋葱伯克霍尔德菌检查。

2.4 方法适用性试验

2.4.1 供试品组 取1∶10 的供试液10 mL，接种至100 mL的胰酪大豆胨液体培养基中，置32.5 ℃培养箱中培养48 h。取上述预培养物划线接种于洋葱伯克霍尔德菌选择性琼脂基础培养基（每500 mL 培养基中加入1 支BCSA选择性添加剂）平板上，置32.5 ℃培养48 h。

2.4.2 阳性对照组 取1∶10 的供试液10 mL 及1～100 cfu/mL 的洋葱伯克霍尔德菌悬液1 mL，接种至100 mL的胰酪大豆胨液体培养基中，置32.5 ℃培养箱中培养48 h。取上述预培养物划线接种于洋葱伯克霍尔德菌选择性琼脂基础培养基（每500 mL 培养基中加入1 支BCSA 选择性添加剂）平板上，置32.5 ℃培养48 h。

2.4.3 阴性对照组 取pH 7.0 无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液10 mL，接种至100 mL 的胰酪大豆胨液体培养基中，置32.5 ℃培养箱中培养48 h。取上述预培养物划线接种于洋葱伯克霍尔德菌选择性琼脂基础培养基（每500 mL 加入1 支BCSA 选择性添加剂）平板上，置32.5 ℃培养48 h。

2.4.4 结果判断 若洋葱伯克霍尔德菌选择性琼脂基础培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判定为未检出洋葱伯克霍尔德菌。若洋葱伯克霍尔德菌选择性琼脂基础培养基平板上有菌落生长，且为周围黄色的绿棕色菌落，或者周围粉红色的白色菌落，则应进行分离、纯化、镜检鉴定，确认是否为洋葱伯克霍尔德菌。

若阳性对照组检出洋葱伯克霍尔德菌，供试品组和阴性对照组未检出洋葱伯克霍尔德菌，则不可接受微生物（洋葱伯克霍尔德菌）验证试验结果符合要求。验证结果见表2、表3、图1。

表2 蒲地蓝消炎口服液验证结果

表3 纯化水验证结果

图1 验证结果

2.5 结论 阳性对照组检出洋葱伯克霍尔德菌，供试品组和阴性对照组未检出洋葱伯克霍尔德菌，不可接受微生物验证试验结果符合要求。该方法可用于蒲地蓝消炎口服液及纯化水中不可接受微生物洋葱伯克霍尔德菌的检查。

3 讨论

采用涂布法对洋葱伯克霍尔德选择性琼脂基础培养基（BCSA）进行了适用性检查。选取洋葱伯克霍尔德菌（ATCC25416）、新洋葱伯克霍尔德菌（BNCC331058）、多噬伯克霍尔德菌（BNCC301368）进行了BCSA 促生长能力及指示特性检查；选取金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、铜绿假单胞菌（ATCC9027）进行了BCSA 抑制能力检查。培养结果显示，BCSA 对洋葱伯克霍尔德菌、新洋葱伯克霍尔德菌、多噬伯克霍尔德菌有促生长作用，而对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌有抑制能力，空白对照无菌生长，BCSA 适用性检查符合规定。

取公司自制蒲地蓝消炎口服液3 批、纯化水3 批，采用文中经验证过的方法进行检查，结果：每1 mL 蒲地蓝消炎口服液菌未检出洋葱伯克霍尔德菌；每1 mL 纯化水未检出洋葱伯克霍尔德菌。

蒲地蓝消炎口服液自2015 年便收录于《中国药典》中。该品种质量标准中，在理化方面，针对处方药材分别建立了3 个定性及2 个定量成分的研究。在微生物方面，目前仅满足中国药典中对口服给药液体制剂的基本要求，即《中国药典》中对总菌及控制菌的基本要求。洋葱伯克霍尔德菌，作为新出现的一种条件致病菌，污染广，危害大，可考虑将其纳入蒲地蓝消炎口服液质量标准中，并纳入公司纯化水控制标准中，进而从源头保障其他水制剂产品的质量安全。

综上所述，文中建立的检查方法，不仅可以用于蒲地蓝消炎口服液及纯化水中不可接受微生物洋葱伯克霍尔德菌的检查，也可以参考应用到其他水制剂产品的风险评估和安全控制中，对于提升整体药品的安全性，有较大的借鉴意义。