郏县红牛TAFA1基因多态性及其与生长性状的关联分析

吕世杰，李玉龙,2，张志杰，张子敬，陈付英，黄永震，施巧婷，王二耀,*

(1 河南省农业科学院畜牧兽医研究所/河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，郑州 450002；2 河南农业大学动物科技学院，郑州 450046；3 西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100)

郏县红牛主产区为平顶山市为郏县、宝丰和鲁山三县，分布于毗邻的十余个县(市、区)，是我国重要的地方优良品种。1983年被列入河南优良畜禽品种志，1985年10月列入全国八大优良黄牛品种，2006年6月被农业部列入国家级畜禽遗传资源保护名录。郏县红牛具有毛色红润、体型匀称、适应性强、繁殖性能好等特点，是发展肉牛产业和培育优良肉牛品种不可多得的遗传资源。但是，郏县红牛的体躯指数仍低于肉牛的平均体躯指数，肉用性能指数也低于肉牛标准[1]。如果要进一步提升郏县红牛肉用性能和价值，仍然需要进一步对生长性状进行改良提高。

分子育种是郏县红牛高效选育的必经之路，通过开发相关分子标记进行辅助育种能够提升育种效率。到目前为止，已研究鉴定出与肉牛生长有关的基因近80个[2]。例如LEPR基因[3]和NCAPG-LCORL区间被发现与平均日增重显著相关[4-5]，PLAG1基因和TMEM68基因分别与屠宰重和初生重显著相关[6-7]。

TAFA趋化素样家族成员1(TAFA1，TAFA Chemokine Like Family Member 1)是能编码小分子蛋白的TAFA基因家族中的一员，编码的蛋白在固定位置含有保守的半胱氨酸残基并与MIP-1 alpha(CC趋化因子家族成员)有关，其主要在大脑中表达[8]。该基因位于中国和牛的选择信号区域，表明该基因与中国和牛的某些表型性状形成有关[9]。但该基因是否与牛的生长性状相关还鲜有报道。本研究选择该基因进行研究，拟探究郏县红牛TAFA1基因的遗传变异及其与生长性状的关系，以期为郏县红牛高效选育相关分子标记的开发和利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以79头郏县红牛成年母牛为试验对象，群体来源于郏县红牛保种场。每头个体测量体高、体长、胸围、腰角宽、坐骨端宽、尻长、十字部高、荐高、胸深、胸宽、体重等11个生长和体尺性状。

1.2 DNA提取

通过牛颈静脉采血采集每头个体血样。使用DNeasy Blood & Tissue试剂盒(Qiagen，德国)提取血液总DNA。每份DNA利用紫外分光光度计(ND-1000，NanoDrop Technologies，美国)和1%琼脂糖胶检测DNA质量和完整性，样品纯度要求A260/A280 介于1.8～2.0之间。

1.3 引物设计与基因型分析

牛TAFA1基因位于22号染色体，其第一外显子上存在一个错义突变rs137516577(G>C， BTA22:33471934，ARS-UCD 1.2)。该突变可导致氨基酸序列中第4位的结氨酸转变为亮氨酸。本试验根据牛TAFA1基因序列(ENSBTAG00000019041，ARS-UCD 1.2)在该突变上下游设计引物，PCR扩增后将PCR产物进行测序。根据该SNP位点的测序结果，判断每头个体的基因型。上游引物序列为5′-GCTCAAAGCCGGGGGTAATTCT-3′，下游引物序列为5′-TATCCCCCACACTCCCCGTAG-3′，PCR产物长度为329 bp。

1.4 TAFA1基因在各组织中表达量分析

在“Animal Omics Datebase”数据库里查看TAFA1基因在牛各组织间的表达情况(http://animal.nwsuaf.edu.cn)[10]。基因表达数据由FPKM值表示。

1.5 数据统计与分析

计算rs137516577位点的的基因频率和基因型频率，并进行哈迪温伯格平衡检测。利用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，分析该位点基因型对郏县红牛生长性状的影响。

1.6 基因同源性分析

利用Ensembl数据库中已有的牛(Bostaurus)、人(Homosapiens)、猪(Susscrofa)和小鼠(Musmusculus)和绵羊(Ovisaries)的TAFA1蛋白质序列(序列号依次为ENSBTAP00000025342, ENSP00000418575, ENSMUSP00000074589, ENSSSCP00000060570, ENSOARP00020029279)，应用EMBL-EBI的Clustal W在线软件(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)[11]，对上述序列进行比对。

2 结果与分析

2.1 TAFA1基因PCR扩增片段测序结果

对PCR产物进行反向测序，通过测序结果查验每头牛的基因型(详见图1)。本研究群体共有GG和GC两种基因型，分别为18头和61头牛，GG基因型频率为0.23，GC为0.77。G等位基因频率为0.61，C为0.39。χ2 检验值为 31.242，P值小于0.05，表明该位点在本群体中不处于Hard-Wein-berg平衡状态。

图1 TAFA1基因不同基因型的测序峰图

2.2 TAFA1基因多态位点与郏县红牛生长性状的关联分析

对郏县红牛11个生长和体尺性状进行测定，并对TAFA1基因rs137516577 SNP位点不同基因型与这些性状进行关联分析。结果表明，该位点与体长、腰角宽、坐骨端宽、尻长和体重等性状显著相关。GC型个体的生长和体尺性状均高于GG型个体(详见表1)。

2.3 TAFA1基因在牛中的组织表达分析

根据“Animal Omics Datebase”数据库中的不同牛组织RNA-seq数据，查看TAFA1基因的组织表达情况(图2)。TAFA1基因在脑组织中高表达，其中在大脑中表达最高(FPKM为10.69)，在下丘脑中表达次之(FPKM为4.40)。

2.4 TAFA1基因同源性分析

牛TAFA1基因共编码133个氨基酸，同源性分析表明牛与人、小鼠、猪、绵羊的氨基酸序列相似度分别为99.25%、98.50%、98.50%和100.00%，证实该基因在进化过程中十分保守(详见图3)。

表1 rs137516577 SNP位点不同基因型与郏县红牛生长性状的关联分析

图2 TAFA1基因在牛不同组织中的表达情况(标示的数字为FPKM值)

图3 不同物种TAFA1氨基酸序列比对

3 讨论

本研究通过TAFA1基因上错义突变rs137516577不同基因型与郏县红牛生长性状的关联分析，发现该突变位点与体长、腰角宽、坐骨端宽、尻长和体重等性状显著相关，暗示该基因可能参与调控郏县红牛生长，该突变位点可以作为郏县红牛生长选育的分子标记。

TAFA1基因位于牛22号染色体的32～33 Mb。该区域上存在一个中国西门塔尔牛18月龄体重相关的QTL(QTL_193800，BTA22: 32709940-32709944)[12-13]，间接表明TAFA1基因可作为牛生长性状相关候选基因。目前关于TAFA1基因的功能研究还较少，不过研究认为TAFA家族基因对神经系统调节具有重要作用，在小鼠中能够影响运动、食物摄入等生理学活动[14]。Xia等人也证实了TAFA1基因在小鼠中具有调控采食的功能[15]。此外，研究表明TAFA5基因可以促进人胃癌细胞的增殖和迁移[16]。同源性分析结果显示，该基因在牛、小鼠、猪、绵羊等物种中氨基酸序列相似性极高，同源蛋白在进化过程属于序列保守性，进一步说明该基因对哺乳动物的重要性和功能的一致性。本研究也通过测序数据发现TAFA1基因在牛大脑中高表达，这与人和小鼠中的研究结果也是一致的[8]。所以，我们推测TAFA1或可通过影响采食或肌肉、骨细胞的增殖影响牛的生长。但是，该结论还需要进一步设计试验进行验证。

本研究中，由于样品缺乏系谱信息、饲养环境等可能影响表型的其他因素，统计模型中未能将这些因素作为因子带入模型，可能会影响结果的准确性。在本群体中，该SNP位点不处于Hard-Weinberg平衡状态，可能为人工选择所致。不过，在本群体中未发现CC基因型，这可能与样本量偏低有关。因此，相关结果需要在大群体中进行进一步验证。

4 结论

本研究检测了TAFA1基因上的1个单核苷酸多态性位点rs137516577在郏县红牛群体中等位基因的分布情况，并通过与生长和体尺性状的关联分析发现该多态位点与体长、腰角宽、坐骨端宽、尻长和体重等性状显著相关，且GC型个体均显著高于GG型。研究表明，该SNP位点可作为郏县红牛生长性状选育的分子标记，用于郏县红牛的品种改良。