椭圆叶米仔兰化学成分及其生物活性

2022-01-27 14:41韩晶晶陈梦莹
中成药 2022年1期
关键词:粉末甲醇椭圆

韩晶晶, 陈梦莹, 岑 娟, 李 钦, 张 峰*

(1.河南大学药学院,河南 开封 475004;2.河南大学天然药物与免疫重点实验室,河南 开封 475004)

椭圆叶米仔兰Aglaiarimosa(Blanco) Merrill是一种楝科、米仔兰属、芸香目的常绿灌木或小乔木,其小枝有锈色鳞片,圆锥花序腋生[1]。楝科米仔兰属植物由于喜温暖而湿润的气候和对低温敏感的生长习性,主要分布在东南亚热带雨林地区[2],该属中的米仔兰在民间可以作为药用,其叶味辛,微温,入肺、胃、肝经,有活血散疲、消肿止痛的功效,用于治疗跌打、骨折、风湿、痈疫;其花味甘,性辛,有行气解郁的功效,用于治疗气郁胸闷、食滞腹胀[3-4]。米仔兰属植物化合物结构种类繁多,除了常见的萜类、甾体类外还有木脂素类,具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌活性[5-6]。本实验对椭圆叶米仔兰的茎皮化学成分进行深入的研究,从中分离出17个化合物,均为首次从该植物中分离得到,其中化合物10~11、15~16均表现出抗菌和抑制肿瘤细胞增殖的作用。

1 材料

摇摆式高速万能粉碎机(林大机械有限公司);JHBE-100A型闪式提取器(智晶生物科技科技股份有限公司);Buchi旋转蒸发仪;LC-20AT型高效液相色谱仪、LC-6A型高效液相色谱仪(制备型)(日本岛津公司);基质辅助激光解析离子飞行质谱检测仪、AVANCE AV-400核磁共振波谱仪(德国Bruker公司);Agilent 1100 Series LC/MSD Trap 质谱仪(美国安捷伦公司)。乙醇、甲醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮均为分析纯,购自天津市富宇精细化工有限公司;色谱纯甲醇、乙腈购自天津市四友精细化学品有限公司;氘代甲醇、氘代氯仿购自宁波旋光医药科技有限公司。硅胶 GF254薄层板和柱层析硅胶(200~300、300~400目)均购自青岛海洋化工有限公司;ODS反相柱层析填料购自上海博势生物科技有限公司。

药材来源于云南西双版纳,由河南大学药学院袁王俊教授鉴定为椭圆叶米仔兰Aglaiarimosa(Blanco) Merrill。

2 提取与分离

椭圆叶米仔兰茎枝(10 kg)经粉碎后按料液比1∶10加95%乙醇,用闪式提取器提取,提取时间分别是1档2 min、2档1 min、三档1 min,重复提取3次。提取液经减压回收至无醇味,浓缩液用水混悬,分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取,得到相应部位浸膏。

二氯甲烷部位浸膏经硅胶柱色谱石油醚-乙酸乙酯(20∶1~2∶1)梯度洗脱后TLC检测合并,得到Fr.1~Fr.4流分,Fr.2、Fr.4经LC-6AD高效液相色谱仪-制备型分离纯化得化合物8(6.2 mg)、5(21.5 mg)、9(4.8 mg);Fr.3经ODS柱色谱(10%~60%甲醇)梯度洗脱,其中在20%、30%甲醇部位得化合物6(19 mg)。乙酸乙酯部位浸膏经硅胶柱色谱二氯甲烷-甲醇(20∶1~5∶1)梯度洗脱后经TLC检测合并后共得到7个流分Fr.1~Fr.7,Fr.1、Fr.2直接得化合物2(24 mg)、10(129.5 mg);Fr.3、Fr.5、Fr.6经LC-6AD高效液相色谱仪-制备型分离纯化得化合物17(62.7 mg)、11(44.6 mg)、7(7.3 mg)、13(69.1 mg)、12(126.5 mg)、15(43.4 mg)、14(58.3 mg)、16(43.4 mg)、1(46.3 mg);Fr.4经ODS柱色谱(10%~60%甲醇)梯度洗脱,在20%甲醇部位直接得化合物3(21.3 mg)、4(75.1 mg)。

3 结构鉴定

化合物1:白色无定形粉末,ESI-MSm/z:178.4[M+Na]+。1H-NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ:6.99(J=33.6,1.9 Hz,3H),6.87~6.65(7H),4.61(J=1.9 Hz,1H),4.23~3.95(3H),3.80(1H),3.35(J=1.7 Hz,1H),2.93~2.69(3H);13C-NMR(100 MHz,Methanol-d4)δ:158.0(C-5′,7′,9′),156.5(C-5′,7′,9′),154.1(C-5,7,9),154.0(C-5,7,9),145.4(C-5,7,9),144.6(C-4′),144.4(C-3′,4),144.2(C-3),131.0(C-1′),130.6(C-1),118.1(C-6′),117.8(C-6),114.5(C-5,5′),114.0(C-2′),113.8(C-2),101.7(C-8′),99.8(C-10,10′),99.3(C-6′),99.2(C-6),99.1(C-8),78.3(C-2′),75.9(C-2),71.3(C-3),66.1(C-3′),36.3(C-4),28.2(C-4′),以上数据与文献[7]基本一致,故鉴定为(±)-6-linalyl-7-hydroxycoumarin。

化合物2:白色白色无定形粉末,10%香草醛浓硫酸显红色,放置后变棕黄色,提示该化合物为三萜皂苷类或甾体皂苷类成分[8]。ESI-MSm/z:331.2[M+H]-。1H-NMR(400 MHz,Chloroform-d)δ:4.33~4.21(1H,H-2),3.53~3.21(2H,1H,J=11.4,3.9 Hz,H-3a,3b),2.16(1H,J=9.0,6.4 Hz,H-2′),0.95~0.80(3H,J=6.9 Hz,16′-CH3);13C-NMR(100 MHz,Chloroform-d)δ:35.2(C-1),28.0(C-2),78.7(C-3),35.7(C-4),139.3(C-5),121.1(C-6),28.3(C-7),28.8(C-8),41.3(C-9),32.9(C-10),20.1(C-11),36.3(C-12),37.9(C-13),49.1(C-14),23.3(C-15),27.1(C-16),44.8(C-17),10.7(C-18),18.8(C-19),33.3(C-20),18.4(C-21),28.8(C-22),28.3(C-23),38.8(C-24),25.1(C-25),18.0(C-26),17.8(C-27),22.0(C-28),11.7(C-29),100.2(C-1′),72.4(C-2′),72.8(C-3′),55.8(C-4′),69.3(C-5′),55.1(C-6′),173.4(C-1′),30.9(C-2″),以上数据与文献[9]基本一致, 故鉴定为β-谷甾醇-3-O-6-棕榈酰葡萄糖苷。

化合物3:无定形粉末,ESI-MSm/z:290.3[M+H]-。1H-NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ:6.83(1H,J=1.9 Hz,H-2′),6.80(1H,J=8.04 Hz,H-6′),6.67(1H,J=8.12 Hz,H-5′),5.90(1H,J=2.24 Hz,H-8),5.67(1H,J=2.20 Hz,H-6),4.55(1H,J=7.5 Hz,H-2),3.97(1H,J=7.8,5.3 Hz,H-3),2.50(1H,J=16.0,8.1 Hz,H-4a);13C-NMR(100 MHz,Methanol-d4)δ:27.1(C-4),67.4(C-3),81.5(C-2),94.2(C-8),94.8(C-6),99.4(C-4a),113.9(C-2′),114.7(C-5′),118.7(C-6′),130.8(C-1′),144.8(C-3′),155.5(C-4′),156.2(C-8a),156.4(C-7)。以上数据与文献[10]基本一致,故鉴定为儿茶素。

化合物4:无定形粉末,ESI-MSm/z:290.3[M+H]-。1H-NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ:6.99(1H,H-2′),6.76(2H,H5′,6′),5.94(1H,J=2.0 Hz,H-8),5.91(1H,J=2.0 Hz,H-6),4.19(1H,J=7.5 Hz,H-2),3.34(2H,J=16.5 Hz,H-4);13C-NMR(100 MHz,Methanol-d4)δ:156.6(C-5),156.3(C-7),156.0(C-9),144.5(C-3′),144.4(C-4′),130.9(C-1′),118.0(C-6′),114.5(C-2′),113.9(C-5′),98.7(C-10),95.0(C-6),94.5(C-8),78.5(C-2),66.19(C-3),27.9(C-4)。以上数据与文献[11]基本一致,故鉴定为表儿茶素。

化合物5:无定形粉末,ESI-MSm/z:224.4[M+Na]+。1H-NMR(400 MHz,Chloroform-d)δ:5.86(1H,H-4),3.37(1H,H-9),2.21(1H,J=18, 1 Hz, H-2),2.16(3H,J=1 Hz,H-13),1.36(3H,J=6 Hz,H-10),1.26(3H,H-12),1.15(3H,H-11);13C-NMR(100 MHz,Chloroform-d)δ:209.6(C-9),198.6(C-7),118.7(C-6),100.8(C-8),72.4(C-5),63.8(C-3),48.8(C-2),48.7(C-4),36.1(C-1),31.7(C-12),30.9(C-13),29.2(C-11),26.4(C-10),以上数据与文献[12]基本一致,故鉴定为lyratol F。

化合物6:无定形粉末,ESI-MSm/z:226.3[M+Na]+。1H-NMR(400 MHz,Chloroform-d)δ:7.18(2H,H-2,6),3.94(2H,J=6.1 Hz,H-9),3.88(6H,3,5-OCH3),3.13(2H,J=6.1 Hz,H-8);13C-NMR(100 MHz,Chloroform-d)δ:198.9(C-7),146.9(C-2,6),140.1(C-4),128.3(C-1),105.6(C-3,5),58.3(C-9),56.4(C-2,6-OCH3),39.9(C-8), 以上数据与文献[13]基本一致,故鉴定为3-羟基-1-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-1-丙酮。

化合物7:无定形粉末,ESI-MSm/z:332.1[M+H]-。1H-NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ:6.98(J=1.9 Hz,1H),6.84~6.74(2H),5.97~5.91(2H),4.21(J=4.6,3.0,1.4 Hz,1H),3.43~3.29(9H),2.93~2.79(1H),2.74(J=16.8,3.1 Hz,1H);13C-NMR(100 MHz,Methanol-d4)δ:156.6(C-7),156.3(C-5),156.0(C-9),144.5(C-4′),144.4(C-3′),130.9(C-1′),118.0(C-6′),114.5(C-5′),113.9(C-2′),98.6(C-10),95.0(C-8),94.5(C-6),78.4(C-2),66.1(C-3),56.1(-OCH3),55.9(-OCH3),55.6(-OCH3),27.9(C-4),以上数据与文献[14]基本一致,故鉴定为(2R,3S)-5,7,3′-tri-omethyl-(-)-epicatechin。

化合物8:无定形粉末,ESI-MSm/z:354.4[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,Chloroform-d)δ:8.04~7.93(3H,H-9),7.46(1H,J=7.3 Hz,H-10),6.84~6.83(1H,H-11),6.80~6.69(1H,H-12),4.42(1H,J=2.0 Hz,H-17),3.28~3.81(6H,H-3),3.11(2H,J=5.3 Hz,H-5,6),1.42(4H,H-15~16,18~19);13C-NMR(100 MHz,Chloroform-d)δ:128.7(C-2),57.4(C-3),55.1(C-5),21.7(C-6),108.6(C-7),121.2(C-8),112.9(C-9),113.3(C-10),113.5(C-11),110.8(C-12),122.7(C-13),28.7(C-14),30.8(C-15),54.9(C-16),62.1(C-17),28.3(C-18),24.4(C-19),38.7(C-20),57.3(C-21),以上数据与文献[15]基本一致,故鉴定为育亨宾。

化合物9:无定型粉末,ESI-MSm/z:852.3[M+Na]+。1H-NMR(400 MHz,Chloroform-d)δ:4.16(1H,J=11.7,5.4 Hz,H-2′),3.92(1H,3′-OH),3.72~3.55(1H,J=8.60 Hz,2′-OH),2.34(2H,H-2),1.62(2H,H-3),1.29(6H,H-4,14,15),0.87(3H,H-16);13C-NMR(100 MHz,Chloroform-d)δ:70.3(C-1′),65.2(C-2′),63.3(C-3′),34.2(C-2),31.9(C-14),29.3~29.7(C-4-13),24.9(C-3),22.7(C-15),14.1(C-16),以上数据与文献[16]基本一致,故鉴定为α-棕榈精。

化合物10:无定形粉末,ESI-MSm/z:306.1[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ:6.45(2H,H-2′,6′),5.96(1H,J=2.5 Hz,H-8),5.87(1H,J=2.5 Hz,H-6),4.75(1H,J=7.5 Hz,H-2),4.14(1H,H-3),3.31(1H,J=16.0,5.5 Hz,H-4a),2.56(1H,J=16.2,8.1 Hz,H-4b);13C-NMR(100 MHz,Methanol-d4)δ:27.8(C-4),66.1(C-3),78.5(C-2),94.4(C-8),95.0(C-6),98.7(C-4a),105.6(C-2″,C-6″),130.1(C-1″),132.2(C-4″),145.3(C-3″,C-5″),155.9(C-5,C-7,C-8a),156.3(C-5,C-7,C-8a),156.6(C-5,C-7,C-8a),以上数据与文献[17]基本一致,故鉴定为表没食子儿茶素。

化合物11:无定形粉末,ESI-MSm/z:594.4[M+Na]+。1H-NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ:6.43(3H),5.92(J=22.8 Hz,5H),4.56(J=7.1 Hz,1H),4.00(J=6.5 Hz,1H),3.34(J=15.5 Hz,2H),2.82(J=16.0,5.3 Hz,2H),2.54(J=16.2,7.7 Hz,1H);13C-NMR(100 MHz,Methanol-d4)δ:147.6(C-3′,5′),147.2(C-5),146.1(C-7),138.1(C-1′),137.4(C-6),133.1(C-4′),128.8(C-9),124.8(C-10),106.4(C-8),105.7(C-2′,6′),102.7(C-1″),76.8(C-5″),76.5(C-3″),73.6(C-2″),70.5(C-3a),70.1(C-4″),64.8(C-2a),61.3(C-6″),58.8(5-OCH3),55.6(3′,5′-OCH3),55.3(7-OCH3),45.2(C-3),42.0(C-4),39.8(C-2),32.5(C-1),以上数据与文献[18]基本一致,故鉴定为gallocatechin-(4′-O-7)-epigallocatechin。

化合物12:无定形粉末,ESI-MSm/z:605.2[M+Na]+。1H-NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ:6.58(1H,H-8),6.43(1H,H-2′,6′),4.42(1H,J=6.2 Hz,H-4),4.27(1H,J=7.8 Hz,H-1″),3.83(1H,J=10.0,5.5 Hz,H-3αa),3.76(3H,7-OCH3),3.36(6H,H-2″~6″),3.33(3H,5-OCH3),2.68(1H,J=15.2,4.7 Hz,H-1a),2.21(1H,J=15.2,11.4 Hz,H-1b),2.16(1H,H-3),1.66(1H,H-2);13C-NMR(100 MHz,Methanol-d4)δ:147.6(C-3′,5′),147.2(C-5),146.1(C-7), 138.1(C-1′),137.4(C-6),133.2(C-4′),128.8(C-9),124.8(C-10),106.4(C-8),105.7(C-2′,6′),102.8(C-1″),76.8(C-5″),76.5(C-3″),73.6(C-2″),70.5(C-3a),70.1(C-4″),64.8(C-2a),61.3(C-6″),58.8(5-OCH3),55.6(3′,5′-OCH3),55.3(7-OCH3),45.2(C-3),42.0(C-4),39.8(C-2),32.5(C-1) 以上数据与文献[19]基本一致,故鉴定为(-)-南烛木树脂酚-3α-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物13:无定形粉末,ESI-MSm/z:514.7[M+Na]+。1H-NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ:6.81(1H,J=8.0 Hz,H-5′),6.72(1H,J=2.0 Hz,H-2′),6.67(1H,H-8),6.11(1H,H-5),4.15(1H,J=7.5 Hz,H-1″),3.96(1H,H-3),3.72(3H,3′-OCH3),3.34(6H,H-2″~6″),2.85(1H,H-1),1.88(1H,H-4);13C-NMR(100 MHz,Methanol-d4)δ:147.5(C-3′),145.7(C-5),144.4(C-4′),143.7(C-7),137.3(C-1′),133.0(C-2), 127.8(C-1),121.8(C-6′),116.0(C-3),114.8(C-5′),112.9(C-2′),111.0(C-6),103.8(Glc C-1),76.7(Glc C-3),76.4(Glc C-5),73.8(Glc C-2),70.2(Glc C-4),68.2(C-9′),63.8(C-9),61.3(Glc C-6),55.1(6-OCH3),55.1(3′-OCH3),46.6(C-7′),44.5(C-8′),38.2(C-8),32.5(C-7),以上数据与文献[20]基本一致,故鉴定为(+)-异落叶松脂素-9′-O-β-吡喃葡萄糖苷。

化合物14:无定形粉末,ESI-MSm/z:605.1[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ:6.82(1H,H-4),6.64(2H,H-1′,6′),4.37(1H),4.34(1H),4.24(1H),3.89(1H,H-7a),3.82(3H,3-OCH3),3.73(6H,3′,5′-OCH3),3.54(1H,J=4.8 Hz,H-6a),3.44(1H,H-7a),3.21(3H,1-OCH3),2.08(1H,H-7),1.64(1H,H-6);13C-NMR(100 MHz,Methanol-d4)δ:147.6(C-3′),147.5(C-3),145.8(C-2),144.5(C-4′),143.8(C-10),137.4(C-2′),132.3(C-1′),127.9(C-9),122.1(C-6′),116.0(C-7),114.6(C-5′),112.6(C-4),111.0(C-1″),102.3(C-3″),76.8(C-5″),76.4(C-2″),73.6(C-4″),70.0(C-7a),69.4(C-6a),64.1(C-6″),61.1(CH3O-3),55.2(CH3O-3′), 55.0(C-8),43.9(C-7),39.8(C-6),32.3(C-5),以上数据与文献[21]基本一致,故故鉴定为(6S,7S,8R)-7α-[(β-D-glucopyranosyl)oxy]isolariciresinol。

化合物15:无定形粉末,ESI-MSm/z:577.9[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ:6.94(1H,J=2.0 Hz,H-10),6.83(1H,J=2.0 Hz,H-10′),6.73(3H,H-13,13′~14′),6.21(2H,H-6,8),5.96(1H,H-6′),4.62(H2),4.55(1H,J=13.0 Hz,H-2′),4.58(1H,J=6.0 Hz,H-4),4.09(1H,H-3),3.93(1H,J=13.0,8.0 Hz,H-3′),2.48(1H,J=14.0,7.5 Hz,H-4′b);13C-NMR(100 MHz,Methanol-d4)δ:158.0(C-7),156.6(C-5′),153.5(C-7′),153.50(C-5),144.8(C-11′),144.5(C-11),144.3(C-12),130.9(C-9),130.9(C-9′),118.7(C-14),117.9(C-14′),114.7(C-13′),114.6(C-13),113.9(C-10′),113.9(C-8′),100.0(C-4α),99.2(C-4α′),81.2(C-2′),75.9(C-2),71.3(C-3),67.4(C-3′),36.3(C-4),27.2(C-4′),以上数据与文献[22]基本一致,故鉴定原花青素B1。

化合物16:无定形粉末,ESI-MSm/z:577.9[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ:4.16(1H,HA3),2.33(1H,J=14.5 Hz,HA4α),6.98(1H,J=2.0 Hz,HA2′),6.62(1H,J=8.0 Hz,HA5′),4.88(1H,HB2),5.77(1H,HB6),5.71(1H,HB8),6.68(1H,J=8.0 Hz,HB5′),6.77(1H,J=8.0,2.0 Hz,HB6′);13C-NMR(100 MHz,Methanol-d4)δ:158.0(C-5′,7′,9′),156.6(C-5′,7′,9′),154.1(C-5,7,9),154.0(C-5,7,9),145.4(C-5,7,9),144.5(C-4′),144.4(C-3′,4),144.3(C-3),130.9(C-1′),130.6(C-1),118.1(C-6′),117.8(C-6),114.6(C-5,5′),114.0(C-2′),113.8(C-2),101.7(C-8′),99.7(C-10,10′),99.3(C-6′),99.2(C-6),99.1(C-8),78.3(C-2′),75.9(C-2),71.3(C-3),66.1(C-3′),36.3(C-4),28.2(C-4′),以上数据与文献[22]基本一致,故鉴定为原花青素B2。

化合物17:无定形粉末,ESI-MSm/z:577.9[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ:6.98(2H,H-10,10′),6.79(2H,J=8.0,3.0 Hz,H-14),6.74(2H,H-13,13′),6.63(2H,J=8.0,2.0 Hz,H-14′),6.52(1H,H-6′),6.28(1H,J=2.0 Hz,H-6),6.13(1H,J=2.0 Hz,H-8),4.62(1H,J=7.5 Hz,H2),4.57(1H,H-2′),4.49(1H,J=8.5 Hz,H4),4.35(1H,H-3′),4.31(1H,J=8.5 Hz,H3),2.91(1H,J=16.0,5.5 Hz,H-4′ a),2.53(1H,J=16.0,8.0 Hz,H-4′ b);13C-NMR(100 MHz,Methanol-d4)δ:157.18(C-9),155.6(C-7),154.4(C-5, 5′, 7′),154.2(C-9′),153.4(C-12),144.7(C-11,12′),144.4(C-1′),131.2(C-9′),130.5(C-9′),119.3(C-14),118.5(C-14′),115.1(C-13),114.9(C-10′),114.8(C-13′),114.2(C-10),106.9(C-8′),105.9(C-8),100.9(C-6′),82.6(C-6′),81.0(C-2),72.4(C-2′),67.5(C-3),67.2(C-3′),37.1(C-4),27.4(C-4′),以上数据与文献[17]基本一致,故鉴定为原花青素B3。

4 活性测试

4.1 抗菌活性测试 以不加化合物琼脂板为对照组,采用稀释涂布平板法将稀释至1×104CFU/mL金黄色葡萄球菌液涂布于营养琼脂平板,分别加入质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的化合物1~17溶液各1 mL,在37 ℃下培育24 h后用倒置荧光显微镜和肉眼观察是否有细菌生长。以完全没有菌生长的最低药物浓度作为该药物对实验菌的最低抑菌浓度(MIC),重复3次,取平均值。结果,化合物4、10~11、15~17对金黄色葡萄球菌有抗菌效果,其MIC分别是1.0、1.0、1.0、1.0、0.8、1.0 mg/mL,而且抑菌率与其质量浓度呈正相关。

4.2 细胞毒活性测试 以紫杉醇为对照组,采用MTT法测定各化合物对6种人肿瘤细胞株(急髓白血病HL-60、结肠癌HT-29、直肠癌HCT-116、乳腺癌MDA-MB-231、肺癌A549、慢性髓系白血病K562)和1种人正常肝细胞株(HL-7702)的细胞毒活性。结果,化合物1、6、10~11、15~16对7种细胞株表现出不同的细胞毒活性,见表1。

表1 细胞毒活性实验中各化合物IC50 值

综上所述,从椭圆叶米仔兰茎枝中提取的化合物10~11、15~16在抗菌活性、细胞毒活性测试中均有较好的效果,而且均为黄酮类成分,推测它们对肿瘤细胞增殖可能有一定的抑制作用。

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