UPLC-MS/MS法测定止咳平喘中药制剂中16种非法添加化学药物

汪瑾彦， 梁 祈， 庄 玥， 蔡 霞

(广东省药品检验所，广东 广州 510663)

随着经济社会发展，哮喘已成为常见疾病之一[1]。一些不法分子为了达到速效目的，在止咳平喘中药制剂中非法添加化学药物，患者在不知情时服用了这些药物，可能会对健康造成严重危害。

目前，我国止咳平喘类中药中非法添加化学药物的检测标准是药品补充检验方法2009031，涉及8种药物(茶碱、磺胺甲噁唑、醋酸泼尼松、地西泮、马来酸氯苯那敏、盐酸苯海拉明、枸橼酸喷托维林、磷酸苯并哌林)，采用HPLC法检查和定量，LC-MS/MS法确证，并且均各采用2个色谱系统进行分离。但该类添加通常为复合添加，故亟需提高检验效率，扩充检验成分。

上述药物大多采用HPLC法[2-5]、LC-MS/MS法[6-11]、薄层色谱法[12-14]等技术，通常以检测8～18种为主[6-11]，一般检出1～4种阳性[6-10]，部分侧重于定性筛查[9-10]。本研究选择药品补充检验方法2009031中的8种药物，结合近年来发现的其他8种作为研究对象，建立UPLC-MS/MS法同时测定上述16种非法添加物的检测方法，以期为相关监管提供有力的技术支撑。

1 材料

1.1 仪器 LC-30 超高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SCIEX QTRAP5500三重四极杆线性离子阱质谱仪(配ESI源)(美国Sciex公司)；KQ-300DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 茶碱、磺胺甲噁唑、醋酸泼尼松、地西泮、马来酸氯苯那敏、盐酸苯海拉明、枸橼酸喷托维林、磷酸苯并哌林、对乙酰氨基酚、磷酸可待因、甲氧苄啶、盐酸二氧丙嗪、氢溴酸右美沙芬、阿司匹林、双氯芬酸钠对照品均购自中国食品药品检定研究院；盐酸异丙嗪对照品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。乙腈、甲酸(色谱纯)；甲醇、甲酸铵(分析纯)；0.22 μm针式滤膜过滤头(津腾实验室设备有限公司)；实验用水为超纯水。

2 方法

2.1 对照品溶液制备 精密称取上述16种药物对照品各10 mg，置于同一10 mL棕色量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，制成质量浓度为1.0 mg/mL的贮备液，甲醇逐级稀释成1.0、2.0、3.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 ng/mL系列溶液，即得。

2.2 样品前处理

2.2.1 固体样品 胶囊取内容物，片剂、丸剂研磨成粉末后混匀，准确称取0.3 g至50 mL量瓶中，加适量甲醇超声提取15 min，放冷至室温，甲醇定容至刻度，摇匀，根据实际质量浓度稀释至线性范围内，过0.22 μm微孔滤膜后待测。

2.2.2 液体制剂 摇匀后，准确量取1.0 mL至50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声提取15 min，放至室温，甲醇定容至刻度，摇匀，根据实际浓度稀释至线性范围内，过0.22 μm微孔滤膜后待测。

2.3 分析条件

2.3.1 色谱 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相乙腈(A)-10 mmol/L甲酸铵(0.1%甲酸)(B)，梯度洗脱(0～0.5 min，5%A；0.5～9 min，5%A～70%A；9～10 min，70%A；10～11 min，70%A～95%A；11～13 min，95%A；13～13.1 min，95%A～5%A；13.1～16 min，5%A)；体积流量0.3 mL/min；柱温40 ℃；样品室温度4 ℃；进样量1 μL。

2.3.2 质谱 电喷雾离子源(ESI)，多反应监测(MRM)；气帘气35 psi(1 psi=6.895 kPa)；离子源温度550 ℃；喷雾气55 psi；辅助加热气55 psi；阿司匹林、双氯芬酸为负离子模式扫描，离子化电压-4 500 V；其他药物为正离子模式扫描，离子化电压5 500 V。质谱参数见表1。

表1 16种药物优化质谱条件

3 结果与讨论

3.1 色谱条件优化

3.1.1 色谱柱选择 本实验比较了Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×50 mm, 1.8 μm)，结果前者分离效果较后者更优，并且可满足仪器分析要求。

3.1.2 流动相选择 止咳平喘类药物通常以有机相(乙腈或甲醇)-缓冲盐水溶液的混合溶剂体系作为流动相，由于乙腈柱压更小，而且质谱响应值更高，故选用乙腈作为有机相[15]。

本实验分别以乙腈-0.1%甲酸、乙腈-20 mmol/L乙酸铵、乙腈-10 mmol/L甲酸铵(0.1%甲酸)、乙腈-10 mmol/L乙酸铵(0.1%乙酸)为流动相，结果乙腈-0.1%甲酸、乙腈-20 mmol/L乙酸铵洗脱时，部分目标物保留时间接近，峰型较差；乙腈-10 mmol/L甲酸铵(0.1%甲酸)、乙腈-10 mmol/L乙酸铵(0.1%乙酸)洗脱时，目标物响应值较高，峰型较好，大部分药物能较好地分离。考虑10 mmol/L甲酸铵(0.1%甲酸)体系中地西泮与双氯芬酸分离度优于10 mmol/L乙酸铵(0.1%甲酸)体系中，因此，选择乙腈-10 mmol/L甲酸铵(0.1%甲酸)作为流动相。

3.2 质谱条件优化 本实验采用直接进样的方式，分别将16种药物对照品溶液注入质谱的离子源中，优化质谱条件，分别在正、负离子模式下进行Q1全扫描，选择合适的电离方式和准分子离子。再对准分子离子进行MS2全扫描，以1～2个相对丰度最高的子离子作为定性离子，其中相对丰度较高的离子作为定量离子，然后，在多反应监测模式(MRM)下优化各子离子的去簇电压(DP)和碰撞能(CE)，MRM色谱图见图1。

1.对乙酰氨基酚 2.茶碱 3.可待因 4.甲氧苄啶 5.盐酸二氧丙嗪 6.磺胺甲噁唑 7.马来酸氯苯那敏8.氢溴酸右美沙芬 9.盐酸苯海拉明 10.盐酸异丙嗪 11.枸橼酸喷托维林 12.醋酸泼尼松 13.磷酸苯丙哌林14.地西泮 15.阿司匹林 16.双氯芬酸钠1.paracetamol 2.theophylline 3.codeine 4.trimethoprim 5.dioxopromethazine hydrochloride 6.sulfamethoxazole 7.chlorpheniramine maleate 8.dextromethorphan hydrobromide 9.diphenhydramine hydrochloride 10. promethazine hydrochloride 11.pentoxyverine citrate 12.prednisone acetate 13.benproperine phosphate 14.diazepan 15.aspirin 16.diclofenac sodiom图1 各药物MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of various drugs

3.3 提取溶剂选择 止咳平喘类药物一般以甲醇为溶剂[2-10]，这可能是由于它们具有较好的脂溶性。本实验考察了甲醇对16种药物的提取效果，发现溶解性均较好，回收率达到检测要求，综合考虑成本、试剂毒性等因素，最终以其为提取溶剂。

3.4 方法学考察

3.4.1 专属性试验 本实验选择阳性检出率较高的胶囊剂和口服液2种基质，分别作为固态和液态止咳平喘中药制剂的代表基质。取胶囊和口服液阴性样品若干批，按“1.3”项下方法进行前处理后进样分析，结果均未检出。

3.4.2 线性关系考察 本实验在优化色谱-质谱条件下，对系列质量浓度对照品溶液进行测定，以MRM定量离子对峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)进行回归，结果见表2，表明各药物在各自范围内线性关系良好。再以定量离子对的信噪比S/N≥3作为LOD，≥10作为LOQ，结果见表2。

3.4.3 加样回收率试验 本实验取上述2种基质的阴性样品，加入对照品适量，制成3个质量浓度，每个水平6份，按“1.3”项下方法处理后进样检测，结果见表3。

3.4.4 稳定性试验 取10 μg/L对照品溶液，于 0、2、4、8、12、18、24 h 进样检测，测得各成分峰面积RSD为2.4%～11.0%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

3.5 阳性样品检测 从互联网和实体经营场所收集42批样品，按上述方法检测，检出阳性样品13批(胶囊7批、粉剂3批、丸剂1批、液体制剂2批)，检出率31.0%，其中有10批来自网购，表明网络销售产品具有较大风险；共检出12种药物，其中茶碱、醋酸泼尼松、马来酸氯苯那敏是最为常见的非法添加；较补充检验方法2009031新增的8种药物均检出阳性样品，其中右美沙芬、异丙嗪为国内首次报道。具体见表4。

表2 各药物线性关系Tab.2 Linear relationships of various drugs

表3 各药物加样回收率试验结果(n=6)

不合格样品中，普遍存在多种药物复合添加的情况，而且含量差异巨大，最常见的方式为“茶碱+醋酸泼尼松+其他”，这种联合用药的随意性可能对患者健康造成严重的损害。

4 结论

本实验建立UPLC-MS/MS法同时测定止咳平喘类中药制剂中16种非法添加化学药物，扩充了现有国家标准的检验药物，结果均检出阳性样品，并且首次报道了氢溴酸右美沙芬和盐酸异丙嗪，该方法实用性强，可为相关监督检验提供有力的技术支撑。

表4 阳性样品检测结果