基于网络药理学预测妇血康有机酸治疗功能失调性子宫出血的机制

韦玥吟， 蒋怡萱， 黄盼玲， 吴超权， 李宇清， 夏 星*

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西壮族自治区食品药品检验所，广西 南宁 530000)

功能失调性子宫出血症(dysfunctional uterine bleeding, DUB)在中医属于“崩漏”的范畴，即经血非时暴下或淋漓不止[1]，其基本病理生理特征为中枢神经系统下丘脑-垂体-卵巢轴神经内分泌调控异常，子宫肌层局部调节功能异常或为卵巢、子宫内膜不规则脱落[2]。壮药妇血康以滇桂艾纳香单独成药，有活血化瘀、止血调经功效[3]，其来源于菊科植物假东风草Blumeariparia(Bl.) DC 的干燥全草，《中华药海》有“收敛止血，具有活血不伤血、止血不留瘀之功，可用于各种出血症”的描述[4]，主要用于通火路龙路，用于发旺(风湿骨痛)、林得叮相(跌打肿痛)、兵淋勒(崩漏)、月经不调、狠尹(疮)等症[5]，临床广泛用于经血过多与产后恶露不止的治疗，但是其药效物质基础和作用机制都尚未明晰。

研究表明，妇血康对产后出血的治疗作用主要通过影响凝血、促进子宫收缩2条途径产生[6]，介导其治疗作用的药效物质可能主要在于其水溶性提取部位，尤其是有机酸和多糖[7]。网络药理学可以反映化合物与靶点之间复杂的相互作用，预测药物作用机制[8]。本研究从妇血康中有机酸的化学物质出发，通过网络药理学手段寻找到其作用于功能失调性子宫出血的靶点，分析可能的作用通路，并通过动物实验进行初步验证，为该壮药临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 网络药理学研究

1.1.1 妇血康有机酸部位化学成分数据库构建及作用靶点筛选 利用中国知网、维普、Pubmed等数据库，以妇血康的唯一原料滇桂艾纳香、假东风草或其拉丁文名称Blumeariparia(Bl.) DC.为检索词，检索从滇桂艾纳香中分离的主要有机酸类化合物；利用数据库PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索滇桂艾纳香有机酸化合物的2D、3D化学结构；利用数据库PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)，通过导入化合物3D化学结构获取可能的药效团模型靶点，此外利用中药系统药理数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)搜索化合物的作用靶点，汇总PharmMapper及TCMSP的预测结果，构建妇血康有机酸化学成分作用靶点数据集。

1.1.2 DUB疾病-靶点的筛选 通过OMIM(https://omim.org/)、Gene Cards(https://www.genecards.org/)等数据库，以 “功能失调性子宫出血(dysfunctional uterine bleeding)、子宫出血(uterine bleeding)、子宫收缩(uterine contraction)、平滑肌收缩(smooth muscle contraction)”等为关键词，建立疾病靶点集。

1.1.3 妇血康有机酸部位靶点-DUB疾病靶点网络构建 为进一步了解妇血康有机酸成分与DUB疾病的直接作用关系，取“1.1.1”项下的药物靶点及“1.1.2”项下疾病靶点交集，得到药物-疾病交集靶点。将妇血康有机酸物质靶点与药物-疾病交集靶点导入Cytoscape 3.7.2软件中，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图。将药物-DUB交集靶点导入String(version 11.0)数据库，分析和预测妇血康有机酸部位-DUB的蛋白质-蛋白质相互作用，获得蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction network, PPI)。将从String数据库中所获取得到的相互作用关系网络的tsv文本导入Cytoscape 3.7.2软件中，对靶点进行拓扑属性分析，寻找靶点间的相互作用关系，找出PPI网络中起关键作用的靶点。

1.1.4 GO富集分析与KEGG通路分析 利用Cytoscape 3.7.2软件中的Clue GO，对化合物调控网络中的所有基因进行GO分析，并通过DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)数据库进行KEGG功能注释富集分析。通过GO分析找到靶蛋白可能发生的主要生物进程，通过KEGG分析找到靶蛋白可能参与的信号通路。

1.2 动物实验验证 课题组预实验发现，妇血康有显著促进DUB大鼠子宫收缩的效果。由于妇血康中绝大多数有机酸存在于其70%乙醇总提取物的乙酸乙酯萃取部位中[9]，且离体子宫收缩实验是评价药物对子宫收缩作用的经典方法[10]，因此，本研究进一步纯化乙酸乙酯萃取部位，采用正常大鼠离体子宫，初步验证妇血康的作用途径。

1.2.1 动物 9周龄性成熟未孕雌性SD大鼠，SPF级，体质量220～250 g，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(桂)2014-0002。

1.2.2 试剂与药物 妇血康有机酸成分段的制备：将滇桂艾纳香生药材粉碎后用70%乙醇浸提，浓缩后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对总提取物进行萃取，乙酸乙酯萃取部位用D101大孔树脂吸附，依次用30%、50%、75%、95%乙醇洗脱，根据预实验结果，取乙酸乙酯萃取部位的50%乙醇洗脱物用于验证妇血康的作用靶点。经初步分析，该提取物中含有咖啡酸、原儿茶酸、丁香酸、没食子酸、香草酸等有机酸成分。

戊酸雌二醇片(批号362A，拜尔医药保健有限公司广州分公司)；硫酸阿托品(批号PS060，绍兴民生医药股份有限公司)；乙二胺四乙酸二钠(批号20180614，天津市大茂化学试剂厂)；水合氯醛、盐酸利托君(批号B1826028、F1503113，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。其他试剂均为分析纯。

1.2.3 仪器 BSA224S电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；CD-UPT-Ⅱ超纯水制造系统(成都越纯科技有限公司)；BL-420F生物机能实验系统、HW-400E恒温平滑肌槽(成都泰盟软件有限公司)。

1.2.4 含药血清制备 取性成熟未受孕的雌性SD大鼠10只，随机分为空白血清组、妇血康提取物组(40 mg/kg)，妇血康提取物的用药剂量根据预实验确定。妇血康提取物组大鼠每天灌胃给药1次，连续7 d；空白血清组大鼠每天灌胃等量纯水，末次灌胃给药后腹主动脉取血，静置后离心，取上层血清，即得空白血清、妇血康提取物含药血清。

1.2.5 妇血康对大鼠离体子宫收缩的影响 实验前3 d大鼠每天灌胃给予戊酸雌二醇(0.4 mg/只)，末次给药后1 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取子宫置于盛有洛氏液的培养皿中，固定于恒温浴槽中，一端连接至张力换能器，设置温度为37 ℃。待子宫收缩平稳后，向浴槽中分别加入空白血清、妇血康含药血清，血清体积不断叠加，检测两者对离体子宫平滑肌收缩的影响，以最大收缩力作为药物作用的最大效应(Emax)。此外，分别利用M受体抑制剂硫酸阿托品(0.2 mol/L)、钙离子螯合剂乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na，0.075 3 mol/L)、β2受体抑制剂盐酸利托君(0.002×10-3mol/L)作为工具药，与妇血康含药血清共同孵育，观察子宫收缩Emax的变化，以验证妇血康含药血清的作用途径。

2 结果

2.1 网络药理学

2.1.1 成分筛选 通过检索相关数据库及文献，找到滇桂艾纳香(妇血康)有机酸组成主要为原儿茶酸、咖啡酸、丁香酸、没食子酸、香草酸、呋喃甲酸、水杨酸、2,4-二甲基-6-甲基苯甲酸、绿原酸，共检索到2 225个潜在作用靶点，其中原儿茶酸有241个，咖啡酸有248个，丁香酸有246个，没食子酸有252个，香草酸有238个，呋喃甲酸有176个，水杨酸有226个，2,4-二甲基-6-甲基苯甲酸有299个，绿原酸有299个，去除重合靶点后，总靶点数为321个。

2.1.2 DUB疾病-靶点筛选 OMIM数据库搜索得到624个DUB疾病相关靶点，Gene Cards搜索得到9 610个DUB疾病相关靶点，将2个数据库靶点进行合并、去重，选取相关系数大于等于10者，整合得到DUB疾病相关靶点共1 673个。

2.1.3 有机酸靶点-DUB疾病靶点网络构建 药物-疾病交集靶点共79个，将其导入Cytoscape3.7.2软件中，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图，见图1。其中，节点(node)代表妇血康有机酸部位-DUB疾病存在交集的潜在作用靶点，边(edge)代表妇血康与有机酸、妇血康有机酸成分与潜在靶点、DUB与潜在靶点之间的联系。

图1 有效成分-作用靶点网络图

将妇血康有机酸作用靶点-DUB疾病靶点的交集靶点导入String(version11.0)数据库中，获得蛋白互作关系网络图，见图2，其中节点(node)代表蛋白，边(edge)为节点之间的连线，表示相连的两个蛋白之间具有相互作用。将从String数据库中所获取得到的相互作用关系网络的tsv文本导入Cytoscape 3.7.2软件中，利用插件Network Analyzer对靶点进行拓扑属性分析，结果见图3。PPI网络中共包含45个节点、220条边，ALB、AKT1、MAPK1、SRC、CASP3、EGFR、HSP90AA1、MAPK8、MMP9、ESR1、MAP2K1、RHOA、PIK3R1等靶点可能在妇血康有机酸部位-功能失调性子宫出血网络中具有重要意义。

图2 药物-疾病蛋白互作(PPI)网络图

图3 拓扑属性分析图

2.1.4 GO功能分析、KEGG通路分析 利用Cytoscape 3.7.2软件中的Clue GO，对中药调控网络中的所有基因进行GO功能分析，结果显示，P<0.05的基因共108个，主要涉及类固醇激素受体活性、丝氨酸肽酶活性、蛋白质酪氨酸激酶活性、丝氨酸水解酶活性、有机酸结合、跨膜受体蛋白激酶活性、G蛋白偶联受体结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、磷脂酰肌醇-3-激酶结合等，见表1。通过DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)数据库进行KEGG通路分析，共富集到P<0.05的妇血康有机酸部位作用靶点相关通路42条，包括VEGF信号通路、Ras信号通路、FoxO信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、cAMP信号通路等，见表2。

表1 GO功能分析结果

2.2 动物实验

2.2.1 工具药对离体子宫收缩的影响 与空白平衡状态下的离体子宫比较，阿托品、EDTA·2Na及利托君均能显著抑制离体子宫的收缩，3种药物的最大效应均低于空白平衡状态(P<0.01)，见表3。

2.2.2 工具药对妇血康含药血清调节子宫收缩作用的影响 与空白血清组比较，妇血康含药血清组离体子宫收缩力增强(P<0.01)；与妇血康含药血清组比较，添加阿托品后子宫收缩下降至最大效应的0.67(P<0.01)，但子宫仍呈现弱的兴奋状态，与空白血清组比较，阿托品未出现抑制子宫收缩的作用(P>0.05)；与妇血康含药血清组比较，妇血康含药血清与EDTA·2Na共同孵育下的离体子宫收缩也被抑制(P<0.05)，而妇血康含药血清与利托君共同孵育时，离体子宫收缩能力略有下降，但仍能达到最大效应的0.72，利托君松弛子宫的效应并不显著(P>0.05)。见表4。

表2 KEGG通路富集分析结果

表3 工具药对子宫收缩的影响

表4 工具药对妇血康含药血清调节子宫收缩作用的影响

3 讨论

功能失调性子宫出血是由于下丘脑-垂体-卵巢轴(hypothalamic-pituitary-ovarian axis, HPO)功能失常，机体排卵功能受到抑制，从而使子宫内膜丧失对雌孕激素的周期性调节作用而导致的疾病[11]，与年龄、HPO轴、子宫血管结构功能异常[12]、纤维蛋白溶酶激活物质释放增多有关[13]。目前以壮药滇桂艾纳香为单味成药的妇血康颗粒，已广泛用于DUB的治疗上，但其作用机制的研究较少。

现有研究表明，妇血康颗粒有效成分滇桂艾纳香的有机酸和多糖类物质，可能是其发挥凝血和促子宫收缩作用的主要药效物质[7]。本研究通过网络药理学预测妇血康有机酸对DUB的作用靶点，发现它们可能是其治疗DUB的药效物质，这与Huang等[7]报道是一致的。另外，有机酸类分布的妇血康活性段含药血清在体外有促进大鼠离体子宫收缩的效果。

调节子宫平滑肌的收缩状态可能是妇血康治疗DUB的的主要作用途径[6]。本研究通过GO富集分析和KEGG通路分析发现，妇血康有机酸成分在DUB疾病中对G蛋白偶联受体有直接的作用，并且该受体下游的cAMP信号通路、PI3K-Akt信号通路显著度排名均靠前。β肾上腺素受体正是一种G蛋白偶联受体[14]，子宫平滑肌的β肾上腺素受体兴奋程度决定着子宫的收缩能力。本研究利用作用于不同受体的工具药，在离体子宫实验中验证了妇血康通过β肾上腺素受体对子宫收缩的影响，发现分别将M受体阻断剂阿托品、Ca2+螯合剂EDTA·2Na与妇血康活性段联合使用时，对其促进子宫收缩影响并不显著，但当妇血康与β2受体激动剂利托君共同使用时，利托君松弛子宫平滑肌的作用受到显著抑制，提示妇血康可能是通过阻断β肾上腺素受体从而影响子宫收缩，这验证了在网络药理学研究部分的G蛋白偶联受体参与妇血康有机酸成分治疗DUB的预测。此外，那袭雪等[15]研究了滇桂艾纳香的同科属近缘种植物白花九里明治疗产后出血的作用机制，发现其中的咖啡酸等有机酸物质能显著兴奋小鼠离体子宫平滑肌，并认为其可能是通过影响非选择性β受体发挥作用，这与本研究结果相吻合。

网络药理学结果发现，G蛋白偶联受体、cAMP信号通路及PI3K-Akt信号通路中的关键位点包括PRKACA、GPCR、RhoA、ROCK、Raf1、PI3K、Rac1、Akt等。抑制肌球蛋白轻链(myosinlight chain, MLC)活性可诱导平滑肌细胞发生钙增敏效应，使得阈值水平[Ca2+]i能引起平滑肌超阈值水平收缩。小分子G蛋白Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene family member A, RhoA)在平滑肌收缩过程中的靶标是Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase, ROCK)，受外界刺激时，游离于胞浆中的RhoA活化并向细胞膜聚集与膜结合，将信号传给ROCK，使分子中854位丝氨酸和697位苏氨酸磷酸化而激活，再将其底物肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase, MLCP)磷酸化使之失活，失活的MLCP不能使MLC脱磷酸化，胞浆内MLC磷酸化水平上升，导致平滑肌收缩[16]。激活β2受体可兴奋G蛋白偶联受体，使腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, AC)活化，催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)生成环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)[17-19]，当细胞内的cAMP到达一定水平时，可激活蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)[20]，PKA发生磷酸化抑制RhoA水平，导致ROCK表达降低，ROCK磷酸化水平降低使蛋白磷酸酶1调节亚基12A(protein phosphatase 1 regulatory subunit 12A, MYPT1)水平生高，磷酸化MYPT1抑制MLC水平，使肌球蛋白ATP酶活性降低，最终导致平滑肌舒张，这一调控通路上的多个位点均显示与妇血康有机酸成分高度相关。

综上所述，妇血康作为在壮医药理论指导下开发的壮药，能通过调节子宫平滑肌的收缩能力对功能失调性子宫出血发挥治疗作用，网络药理学结合动物实验验证结果提示，它可能是通过影响大鼠子宫平滑肌中的β2受体或(及)其所在通路从而发挥促进子宫收缩的作用，具体还有待进一步研究。