芒果苷标准样品的定值与不确定度测定

阳辛凤， 庞朝海， 田 海， 郭晓杰， 王 盼

[1.中国热带农业科学院分析测试中心, 海南 海口 571101；2.农业农村部热作产品质量安全风险评估实验室(海口), 海南 海口 571101；3.海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室, 海南 海口 571101；5.海南大学热带农林学院, 海南 海口 570208]

芒果苷是漆树科植物芒果树叶片、百合科植物知母根茎、龙胆科植物藏茵陈等中药材的主要活性成分，具有镇咳、杀菌、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂等药理活性[1-4]。芒果苷为2015年版《中国药典》规定的知母等中药材鉴别和质量控制的重要检测指标[5]，因此，准确测定芒果苷含量对相关产品的质量控制有重要意义。然而目前尚无芒果苷标准样品，与芒果苷检测相关的研究都是基于芒果苷对照品而开展的。国内外公司出售的芒果苷对照品，均未按照国家标准进行均匀性、稳定性和定值试验，纯度没有进行不确定度评价，不具有溯源性，难以作为标准样品使用。

定值与不确定度评价是标准样品制备的重要环节，质量平衡法可直接溯源到国际单位制(SI)中的质量(kg)，是一种潜在的基准方法[6]，也是GB/T 15000.3 标准样品工作导则中推荐的方法[7]，它主要由主成分测定及杂质测定两部分构成，主成分测定常用方法是液相色谱法或气相色谱法，以面积归一化法计算主成分纯度；杂质则主要是指水分、灰分和挥发性成分，其操作简单、可重复性好，在标准样品定值中应用广泛。天然产物类标准样品在农产品、食品、中草药等领域需求很大，近年来天然产物标准样品的研制以及对其特性量值的检验、定值及不确定度评价得到了广泛关注，有证标准样品数量逐渐增多。王尉等报道了表没食子儿茶素没食子酸酯、异补骨脂素、橙皮素、辛弗林、天麻素、黄芩素、芝麻素和水苏糖等天然产物标准样品的研制，并采用质量平衡法法对制备的标准样品进行了定值[8-15]。

为了满足以芒果苷为活性成分的农产品及相关产品的分析检测、质量控制工作的需求，保证检测结果的准确性、可比性和溯源性，急需制备芒果苷标准样品。本文参照GB/T 15000.3 标准样品工作导则，对研制的芒果苷标准样品进行均匀性与稳定性检验，以及采用质量平衡法进行定值和对不确定度进行评价。

1 材料与方法

1.1 试剂 芒果苷标准样品为自制，步骤为将新鲜芒果叶片切碎、粉碎后提取，分离纯化，重结晶，即得到淡黄色针状结晶，70%甲醇超声溶解及定容，制成质量浓度为100 μg/mL的供试品溶液。乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯，美国赛默飞公司)；水为Milli-Q系统超纯水(美国Millipore公司)。

1.2 仪器 Waters 1525高效液相色谱仪，配置紫外检测器(美国Waters公司)；Triple TOF 5600+超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪(美国AB SCIEX公司)；Agilent 7890A气相色谱仪，配置FID检测器与顶空装置[安捷伦科技(中国)有限公司]；SKF-1自动卡尔费休水分测定仪(瑞士Mettler-Toledo公司)；BT25S型电子分析天平(十万分之一，德国赛多利斯公司)；JP-180ST超声波清洗机(900 W，40 kHz，深圳市洁盟清洗设备有限公司)。

1.3 纯度分析 采用HPLC法，条件为Waters Xbridge BEH C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)(85∶15)；体积流量1 mL/min；波长258 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。

1.4 结构分析 条件为电喷雾离子化源(ESI)，负离子模式；质量扫描范围m/z100～900；喷雾电压-4 500 V；雾化气温度550 ℃；气帘气40 L/min；雾化气、辅助气体积流量55 L/min；去簇电压-100 V。采用TOF-MS-IDA-MS/MS方法采集数据，一级预扫描和触发的二级扫描离子累积时间分别为200、100 ms；碰撞能量-35 eV；碰撞能量叠加(CES)(-35±15)eV；触发二级的方法为IDA，多重质量亏损(MMDF)和动态背景扣除(DBS)为触发二级的条件，满足该条件的优先进行二级扫描。

1.5 均匀性检验 均匀性检验包括瓶间、瓶内均匀性检验，其中瓶间均匀性检验方法为随机抽取分装好的标准样品15瓶，采用3种抽样程序，第1组标准样品瓶序号为5-60-23-51-19-2-72-33-80-69-26-93-43-85-17，第2组标准样品瓶序号为17-85-43-93-26-69-80-33-72-2-19-51-23-60-5，第3组标准样品瓶序号为5-23-19-72-80-26-43-17-60-51-2-33-69-93-85；瓶内均匀性检验方法为随机抽取分装好的标准样品1瓶，重复测定10次。采用峰面积归一化法计算纯度，再根据GB/T 15000-2008工作导则要求，通过方差分析处理均匀性测量数据，并进行均匀性评估。

1.6 稳定性检验 稳定性检验包括短期、长期稳定性检验，其中短期稳定性检验是将9组标准样品(每组3瓶)保存在恒温(40±1)℃烘箱中，第1～7天各取出3瓶，第10、15天各取出3瓶，放于4 ℃下，共15 d，每瓶取3个子样，配制成溶液，按“1.3”项下方法分析，检测在规定条件下纯度随时间的变化；长期稳定性检验是将16组标准样品(每组6瓶)在4 ℃下保存19个月，第1～13个月各取出6瓶，第15、17、19个月各取出6瓶，按“1.3”项下方法分析。采用峰面积归一化法计算纯度，再根据GB/T 15000-2008工作导则要求，通过方差分析处理稳定性检验数据，并进行稳定性评估。

1.7 杂质分析

1.7.1 水分 采用卡尔费休库伦滴定法[16]测定。

1.7.2 灰分 参照《有机化工产品灼烧残渣的测定》(GB/T 7531-2008)，采用灼烧法[17]，在650 ℃下灼烧至恒重，电子分析天平称定质量。

1.7.3 有机溶剂残留 采用静态顶空进样-气相色谱-氢火焰离子化检测器法(HS-GC-FID)。条件为DB-624色谱柱(30 m×0.25 mm，1.4 μm)；初始温度45 ℃，恒温5 min，以7 ℃/min升至60 ℃，15 ℃/min升至80 ℃，50 ℃/min升至235 ℃，恒定0.5 min；体积流量1.0 mL/min；分流比5∶1；进样量1 mL；进样口温度200 ℃；检测器温度260 ℃。取0.100 0 g标准样品，加DMSO至2 mL，90 ℃顶空30 min，取1 mL顶空气体进行GC测定。

1.8 定值 采用实验室协作试验定值法，参加的实验室数目为8家，随机抽取24瓶标准样品，每个定值实验室送3瓶，每瓶平行测定2次。定值实验室将标准样品制成100 μg/mL溶液，采用峰面积归一化法计算纯度，将所得数据根据实验室规定和测定方法进行汇总，从技术上剔除查明原因的可疑值后，通过格拉布斯(Grubbs)检验法从统计上剔除可疑值。

GB/T 15000-2008规定，定值结果由标准值和不确定度组成，标准样品特性标准值的测量不确定度uCRM由标准值定值试验的不确定度、均匀性检验的不确定度ubb和稳定性检验的不确定度ults、水分测量引入的不确定度umoisture、灰分测量引入的不确定度uash、溶剂残留测量引入的不确定度usolvent组成。根据上述测定结果，计算芒果苷标准样品的纯度标准值和不确定度。

2 结果

2.1 纯度分析 图1显示，主成分色谱峰只有1个，保留时间5.757 min，响应值高，并且仅在7.599 min处有1个响应微弱的杂质峰，纯度高于99.5%。

1.芒果苷图1 芒果苷色谱图

2.2 结构确证 芒果苷为双苯吡酮类黄酮类化合物，在负离子模式下容易解离，因此离子源选择ESI-，通过针泵进样方式获得一级(TOF-MS)、二级(TOF-MS/MS)质谱图，见图2。由此可知，在芒果苷一级质谱中,其[M-H]-峰为m/z421.079 8，响应最强，为芒果苷脱氢后的母离子，与芒果苷分子(422.084 9)脱氢产物的m/z理论值基本一致；二级质谱的主要碎片峰有m/z301.038 3、331.052 6、271.026 9、259.028 8，均有很强的响应值，为芒果苷结构断裂产物。以上结果与理论预测及文献[18-19]报道一致，因此所检测标准样品为芒果苷。

图2 芒果苷高分辨质谱图

2.3 均匀性检验

2.3.1 瓶间均匀性 结果见表1，方差分析见表2。

表1 瓶间均匀性检验结果(n=3)

表2 瓶间均匀性方差分析

2.3.2 瓶内均匀性 结果见表3，方差分析见表4。

表3 瓶内均匀性检验结果(n=3)

表4 瓶内均匀性方差分析

2.4 稳定性试验

2.4.1 长期稳定性 将标准样品在4 ℃下进行19个月试验，采用优化HPLC法测定标准样品纯度作为特性量参数，测得其范围为99.45%～99.97%。再根据GB/T 15000-2008工作导则要求，采用方差分析计算稳定性监测数据，并进行稳定性评估。

图3 芒果苷长期稳定性试验结果

2.4.1.2 回归分析法 以时间为自变量，纯度为因变量，采用回归分析对长期稳定性数据进行评估。结果，P=0.082，表示回归不显著(对于95%置信水平而言，P<0.05为显著)，即未发现不稳定性，标准样品长期稳定性稳定性良好。

2.4.2 短期稳定性 在夏季长途运输时标准样品时，可能会达到40 ℃的高温，故本实验考察芒果苷在40 ℃、15 d内的短期稳定性，测得其纯度范围为99.81%～99.84%。再根据GB/T 15000-2008工作导则要求，采用方差分析计算稳定性监测数据，并进行稳定性评估。

图4 芒果苷短期稳定性试验结果

直线上各点的标准偏差s2=0.000 250 0，取其平方根s=0.015 81，与斜率相关的不确定度为s(b1)=0.001 165，自由度n-2=1、P=0.95的t因子为12.706，t0.95，n-2×s(b1)=0.014 81，由于|b1|

2.4.2.2 回归分析法 以时间为自变量，纯度为因变量，采用回归分析对短期稳定性数据进行评估。结果，P=0.22，表示回归不显著，即未发现不稳定性，标准样品短期稳定性良好。

2.5 杂质分析

2.5.1 水分 采用自动卡尔费休库伦滴定法测定3次，结果分别为0.17%、0.15%、0.19%，再进行Grubbs检验，发现在0.05水平、检测次数3次时，G95(3)=1.153，水分测量值均为Gi

2.5.2 灰分 3次测定结果分别为0.174%、0.165%、0.139%，再进行Grubbs检验，发现在0.05水平、检测次数5次时，Gi

2.5.3 有机溶剂残留值 芒果苷提取分离与重结晶过程仅使用了甲醇、石油醚、乙酸乙酯，故本实验对三者残留值进行检测，结果见表5，再进行Grubbs检验，发现在0.05水平、检测次数5次时，G95(5)=1.672，Gi

表5 有机溶剂残留测定结果

2.6 定值分析 对8家实验室的数据采用格拉布斯检验法进行检验，测得G95(48)(Xij)均小于G95(48)(2.94)，未发现异常值，呈正态分布，符合GB/T 15000-2008工作导则要求，同法对每家实验室的平均值进行检验，将其看成1组测定值进行异常值检验，也未发现异常值，故将上述数据视为无偏估计值，计算其平均值及标准偏差，见表6，方差分析见表7。

表6 定值测定结果(n=6)

表7 定值方差分析

取包含因子k=2，则标准样品的扩展不确定度uCRM(扩展)=2×uCRM(合成)=0.20%，纯度定值为99.82%，杂质包括水分0.17%、灰分0.159%、有机溶剂残留0.026%，总计0.35%，扣除杂质后，标准值为(100%-0.35%)×99.82%=99.47%。综上所述，标准样的特性值为99.47%，扩展不确定度为0.20%(P=0.95，k=2)。

3 结论

本研究制备的芒果苷标准样品瓶间与瓶内均匀性良好，在40、4 ℃下的短期和长期稳定性分别不少于15 d、19个月，标准样品的纯度标准值为99.47%，扩展不确定度为0.20%。所制备的芒果苷标准样品满足GB/T 15000-2008工作导则要求，可用于芒果苷检测方法校正，以及芒果树叶、知母等中药材、提取物与药品等相关产品的检测和质量控制。